基于Wnt/β-catenin信號通路探究丹參素減輕滋養細胞氧化應激反應的機制

唐 帥,李 陽,黃飛躍,吳富菊

(吉林大學第二醫院 婦產科,吉林 長春130041)

子癇前期(preeclampsia,PE) 是一種多系統共同進展的疾病,其特征為妊娠20 w后出現的高血壓和尿蛋白,或高血壓伴終末器官功能障礙,伴或不伴有尿蛋白,是造成孕產婦及圍產兒死亡的重要原因之一[1]。目前認為子宮-胎盤循環系統的正確建立取決于滋養細胞正常浸潤胎盤床。在胎盤著床的關鍵時刻,由于胎盤內局部的氧化應激過度增加,滋養細胞不斷凋亡,侵襲作用減弱,致使胎盤淺著床,這是其發病的關鍵環節,此時孕婦體內出現血管內皮細胞損傷、細胞凋亡增加等一系列的氧化應激損傷[2-3]。Wnt信號通路是自然界普遍存在且非常保守的信號通路,可以調節胚胎著床、組織穩態以及其他機體機能,包括增殖、遷移、侵襲和凋亡等方面,在生命體內發揮著重大作用[3]。氧化應激是Wnt/β-catenin信號通路調控的重要生物學環節[4],PE發病過程中氧化應激反應過度激活是重要的病理特征[5-6]。近期已有實驗表明,PE患者胎盤組織中GSK-3β、β-catenin和Wnt1的蛋白表達水平降低,而DKK1在PE患者胎盤組織中的蛋白表達水平則增加,這與正常妊娠組相比有顯著差異[6]。因此,Wnt/β-catenin信號通路可能在PE的發病機制中起重要作用,并且可能是預防和治療PE的前瞻性治療目標。

丹參素是丹參中的水溶性酚酸類主要藥效成分之一,是天然抗氧化物質,可以通過提高機體超氧化物歧化酶(ROS)活性,去除ROS,改善氧化應激,從而減輕ROS對細胞毒性的作用,改善細胞缺血缺氧[7]。目前丹參素已被證明可有效改善PE小鼠模型中母體綜合征和胎兒綜合征的預后[8]。因此本研究探討丹參素通過經典Wnt/β-catenin信號通路改善滋養細胞氧化損傷中的作用機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參素(PubChem CID:439435)購買于北京Solarbio公司,產氣厭氧袋D-07購買于日本東京AnaeroPack公司,人絨毛滋養細胞系HTR-8/SVneo購買于上海Ek-Bioscience公司,RPMI-1640培養基和青霉素-鏈霉素溶液購買于美國Gibco公司,胎牛血清購買于美國Clark Bio公司,活性氧檢測試劑盒、Hoechst 33342活細胞染色液(100×)、Western及IP細胞裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購買于上海Beyotime公司,CCK-8試劑盒購買于廣州cellcook公司,GADPH抗體、DKK1抗體、Wnt1抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、vinculin抗體、山羊抗兔二抗和ECL化學發光劑購買于武漢Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1建立HTR-8/SVneo氧化應激模型及實驗組 使用含有抗壞血酸鈉的 Anaeropack 誘導缺氧條件,抗壞血酸鈉是通過氧化降解吸收O2和生成CO2的主要物質[9]。將HTR-8/SVneo細胞在缺氧條件下培養8 h。然后將細胞在標準培養條件下(37℃ 5% CO2)培養16 h,完成2個周期。正常對照組(NC)在標準培養條件下培養48 h。將兩組HTR-8/SVneo細胞進一步分為NC組、正常培養+丹參素處理組(NC+DS)、H/R處理組(HR)和H/R+丹參素處理組(HR+DS)4個組。4組再培養48 h,各組總培養96 h。

1.2.2細胞活力測定 采用CCK-8檢測細胞活力。將HTR-8/SVneo細胞(1×103個細胞/孔)在H/R條件下培養48 h,然后用不同濃度的丹參素(0.01、0.1、1、10和100 μmol·L-1)處理24 h和48 h。各組處理后,每孔細胞中加入10%的CCK-8試劑完全培養基100 μl,37℃孵育2 h。在450 nm處測量光密度來確定細胞活力。

1.2.3HTR-8/SVneo細胞中ROS的產生 DCFH-DA探針是檢測細胞內ROS的主要方法。將細胞核染成藍色的Hoechst 33342作為內參。將DCFH-DA和Hoechst 33342稀釋并按說明配制成工作溶液。取1 ml工作液和細胞在37℃下孵育20 min。細胞用不含胎牛血清和雙抗體的RPMI-1640培養基洗滌3次,然后立即使用熒光顯微鏡觀察和拍照。所有實驗至少重復3次。

1.2.4Western blot檢測 用含蛋白酶磷酸酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白質。用BCA法測定蛋白質濃度。等量的總蛋白(20 μg)在10%SDS-PAGE凝膠上電泳,轉移到0.45 μm PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜2 h,然后用兔抗DKK1(1∶2 000)、Wnt1(1∶500)、GSK-3β(1∶4 000)和β-catenin(1∶6 000)抗體孵育4℃過夜。兔抗GADPH(1∶10 000)和小鼠抗vinculin(1∶10 000)抗體作為對照。用山羊抗兔(1∶4 000)和山羊抗小鼠(1∶50 000)二抗檢測抗體結合情況。使用ECL試劑盒檢測目的條帶。結果重復3次以上,使用Image J軟件對圖像進行灰度值分析。

1.3 統計學方法

使用SPSS 26.0軟件進行分析。所有數值均以均數±標準差表示,采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度和時間丹參素對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

為了檢測丹參素對能否改善H/R的HTR-8/SVneo細胞生長,細胞采用不同濃度的丹參素處理(0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1),處理時間為24 h或48 h。研究結果表明,丹參素在上述濃度中對細胞的生長沒有抑制作用,各組在處理24 h后細胞活力無明顯改善(見表1)。處理48 h后,當丹參素為100 μmol·L-1和10 μmol· L-1時,滋養細胞活力均明顯恢復,尤以10 μmol·L-1顯著(P<0.000 1),后續實驗均采用10 μmol·L-1作為丹參素的作用濃度,處理時間為48 h(見表2)。

表1 不同濃度丹參素作用24 h對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

表2 不同濃度丹參素作用48 h對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

2.2 丹參素對HTR-8/SVeno氧化應激的影響

在本研究中,細胞內的 ROS 在氧化應激誘導的細胞損傷中起著關鍵作用;每個細胞中的 ROS 水平是通過測量 DCFH 熒光強度的變化來確定的,以 Hoechst 33342 為參照物將細胞核染成藍色。研究結果表明,H/R處理導致HTR-8/SVneo細胞內ROS積累顯著增加,而丹參素處理則有效緩解了H/R誘導的ROS產生。此外,在正常培養條件下,丹參素處理不會影響細胞內的 ROS 水平。見圖1。

圖1 各組 HTR-8/SVneo 細胞中的ROS 水平

2.3 Western Blot對Wnt信號通路中各分子變化

結果顯示,HR組中的DKK1表達水平較NC組明顯升高(P=0.048 0),加入丹參素處理后,NC+DS組以及HR+DS組中的DKK1表達水平較NC組無明顯差別(P=0.993 2、P=0.299 8),NC+DS組以及HR+DS組中的DKK1轉錄水平較HR組無明顯差別(P=0.101 0、P=0.608 8)。HR組中的GSK-3β轉錄水平較NC組、NC+DS組明顯下降(P=0.009 0、P=0.040 7),加入丹參素處理后,NC+DS組以及HR+DS組中的GSK-3β表達水平較NC組無明顯差別(P=0.690 7、P=0.426 5),HR+DS組中的GSK-3β表達水平較HR組無明顯差別(P=0.081 4)。HR組中的β-catenin表達水平較NC組、NC+DS組以及HR+DS組中均明顯下降(P=0.000 3、P=0.003 4、P=0.006 2),加入丹參素處理,NC+DS組和HR+DS組中的β-catenin表達水平較NC組無明顯差別(P=0.190 7、P=0.097 5),NC+DS組中的β-catenin表達水平較NC組無明顯差別(P=0.960 6)。HR組中的Wnt1表達水平較NC組和HR+DS組中均明顯下降(P=0.043 6、P=0.021 9),NC+DS組和HR+DS組中的Wnt1表達水平較NC組無明顯差別(P=0.954 5、P=0.957 5),HR組和HR+DS組中的Wnt1表達水平較NC+DS組無明顯差別(P=0.089 4、P=0.750 4)。見圖2。

圖2 HTR-8/SVneo 細胞中β-catenin、DKK1、GSK-3β和Wnt1的水平

3 討論

3.1 PE中氧化應激以及Wnt信號通路的改變

氧化與抗氧化的動態平衡調節是人體維持內環境穩定和正常生理功能的重要機制。目前認為過度的氧化應激是PE的重要發病機制,在妊娠的任何階段包括足月妊娠都存在發生一定程度的胎盤氧化應激[10]。產生的ROS不斷損傷滋養細胞,使得它們的浸潤能力受損,浸潤深度過淺,從而造成子宮螺旋動脈重塑不足,胎盤無法有效著床,導致胎盤缺血缺氧-再灌注損傷,氧化應激水平進一步增加[11-12]。但目前氧化應激通過何種途徑使滋養細胞侵襲力降低的具體機制尚不明確。

滋養細胞浸潤能力受損以及胎盤螺旋動脈重鑄不足是PE的發病基礎。WANG等[6]發現與正常胎盤組織相比,重度子癇前患者胎盤中DKK1的表達水平明顯升高,而Wnt1、β-catenin和GSK-3β的表達水平顯著降低,c-myc和cyclinD1的mRNA水平降低,這表明Wnt/β-catenin信號通路可能通過影響滋養細胞的分化、增殖和侵襲等過程在PE的發病中發揮重要作用。經過H/R處理的HTR-8/SVneo細胞顯示出明顯的氧化應激反應,其細胞內ROS水平顯著增加,與PE患者的胎盤組織的情況相似[13]。研究證明,Wnt/β-catenin信號通路激活能夠改善細胞的氧化應激狀態[14]。在H/R處理組中,細胞中β-catenin蛋白的表達量顯著低于正常對照組,同時ROS水平和細胞凋亡也有所增加。使用LiCl能夠抑制細胞內ROS積累,改善滋養細胞的氧化應激,降低滋養細胞凋亡,在一定程度上恢復β-catenin的表達,增強滋養細胞的浸潤能力[15-16]。本研究利用H/R處理的HTR-8/SVneo細胞模型,通過蛋白質印跡證實此模型組較正常培養細胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β的表達水平顯著降低,而DKK1的表達水平則顯著升高,同時伴有細胞內ROS的累積。這一結果提示,氧化應激可能通過抑制滋養細胞Wnt/β-catenin信號通路,損傷滋養細胞,使得滋養細胞浸潤能力受損,參與PE發病。

3.2 丹參素對滋養細胞氧化應激損傷的保護作用

丹參素是丹參中的水溶性酚酸類主要藥效成分之一,性狀穩定,能夠被人體快速吸收。它能夠抵抗氧化損傷,保護心血管系統,改善微循環,抑制炎癥和抗腫瘤等廣泛的藥理作用。丹參素通過清除細胞內氧自由基,控制ROS水平,從而減輕細胞氧化損傷,以達到保護細胞的作用[17]。滋養細胞氧化損傷后,細胞內ROS明顯增加,添加復方丹參能夠明顯改善,且改善程度與復方丹參濃度呈正相關[18]。丹參素已被證明在改善先兆子癇小鼠模型中母體綜合征的預后方面是有效和安全的[19]。焦波等[20]觀察到丹參注射液聯合硫酸鎂治療PE的患者,其氧化應激水平明顯降低,妊娠結局明顯改善。另一方面,丹參素還能夠通過增加妊娠早期胎盤滋養細胞和血管內皮細胞血管內皮生長因子的表達,促進胎盤血管網的形成、滋養細胞的浸潤和母體胎盤循環的構成,減輕血管重鑄障礙,從而增加胎盤血供,改善胎盤缺血缺氧狀態,抑制PE的發展[19]。

本研究在H/R處理的HTR-8/SVneo細胞模型基礎上,經過丹參素處理后,滋養細胞內ROS明顯減少,細胞活力明顯增加,證實了丹參素的抗氧化作用,改善H/R引起的滋養細胞活力下降。Western blot顯示,H/R處理后HR組DKK1明顯升高,而Wnt1、GSK-3β和β-catenin水平明顯降低。經丹參素處理后 HR+DS組Wnt1和β-catenin明顯恢復。這一情況說明,在滋養細胞內氧化應激可以抑制Wnt/β-catenin信號通路表達,經過丹參素處理后,缺氧/復氧的滋養細胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達增加,提示氧化應激主要通過抑制Wnt1蛋白及β-catenin蛋白的表達,阻斷Wnt/β-catenin信號通路,損傷滋養細胞,誘發PE。丹參素能夠明顯改善此過程,保護滋養細胞免受氧化應激的損傷,為治療PE提供了新的思路和方向。

綜上所述,氧化應激抑制了Wnt1和β-catenin水平,抑制了Wnt/β-catenin信號通路,從而損害滋養細胞功能,促進滋養細胞凋亡,降低滋養細胞侵襲性。丹參素能減輕滋養細胞氧化應激,恢復Wnt1和β-catenin水平,重新激活Wnt/β-catenin信號通路,為治療PE提供了新的思路和方向。