T-cadherin通過下調(diào)EGFR-PI3K-AKT信號軸抑制膀胱癌的發(fā)展

崔萬里,衣 琳,宋立友,晉學(xué)飛*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科二病區(qū)·吉林省泌尿系統(tǒng)腫瘤分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·吉林省泌尿系統(tǒng)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春130033;2.吉林市化工醫(yī)院 老年病科,吉林 吉林132021;3.吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長春130012)

膀胱癌(Bladder cancer,BC)是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,目前治療的主要方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)或通過根治性手術(shù)和尿路改道聯(lián)合或不聯(lián)合輔助治療進(jìn)行治療,但BC的治療和診斷仍不能令人滿意,初次治療后的復(fù)發(fā)率高[1-3]。T-鈣黏蛋白(T-cadherin,T-cad)是鈣黏蛋白超家族的非典型成員,在腫瘤新生血管形成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,T-cad的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、臨床病理因素以及癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。表皮生長因子受體(EGFR)通過與其配體的結(jié)合激活后誘導(dǎo)細(xì)胞分化和增殖[7]。有研究表明,細(xì)胞中T-cad的丟失會促進(jìn)EGFR運(yùn)輸和核轉(zhuǎn)位,從而有助于EGFR的促增殖效應(yīng)[8],作為EGFR的下游信號,PI3K-AKT信號的激活在多種腫瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9]。本研究擬探究T-cad是否可通過EGFR-PI3K-AKT信號軸調(diào)控膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織樣本 收取2020年9月至2022年5月間在泌尿外科治療的40例膀胱癌患者膀胱癌組織和血液樣本,其中男 25 例,女 15 例;年齡48～75歲,平均年齡為62.29±8.47歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)依據(jù)《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》診斷為膀胱癌的患者;(2)患者知情同意;(3)行膀胱癌切除術(shù)且切緣未見癌細(xì)胞浸潤的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有精神疾病,依從性較差患者;(2)合并其他惡性腫瘤患者;(3)合并其他器官嚴(yán)重病變患者。收取對照組人群血液樣本,對照組人群為同期就診的非膀胱癌患者40例,按性別相同、年齡±3歲與膀胱癌患者進(jìn)行1∶1匹配,同時(shí)排除以下疾病患者:(1)慢性代謝性疾病,包括高血壓、糖尿病和血脂異常;(2)膀胱疾病,如膀胱炎、膀胱良惡性腫瘤等;(3)其他惡性腫瘤;(4)精神疾病。本研究經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn),并獲得所有患者知情同意。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng) 本研究使用人膀胱癌細(xì)胞系EJ1進(jìn)行相關(guān)研究。

1.1.3主要試劑 SYBR Green PCR master Mix試劑盒,RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗,Lipofectamine 2000,T-cad抗體、EGFR抗體、PI3K p110α、p-AKT抗體,GAPDH抗體。

1.2 方法

1.2.1qPCR檢測膀胱癌患者和對照組人群血清中T-cad mRNA表達(dá)水平 提取血清RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行基因擴(kuò)增,比較兩組T-cad mRNA表達(dá)水平差異。引物設(shè)計(jì)如下,Forward:5’-CTCGTTCTGTGCGTTCTCCTGTC-3’,Reverse:5’-CTCAGAGCAACTAAGCCGCCATC-3’;選擇GAPDH作為內(nèi)參,引物序列,Forward:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,Reverse:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

1.2.2分析T-cad表達(dá)水平與膀胱癌患者性別、年齡、臨床分期和病理分級的關(guān)系 按照血清 T-cad mRNA 的表達(dá)水平(2-△△T公式法)將膀胱癌患者分成T-cad高表達(dá)和低表達(dá)兩組,具體計(jì)算步驟如下:進(jìn)行qPCR反應(yīng)后,同時(shí)測量目的基因T-cad和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值。使用公式2^-ΔΔCt來計(jì)算T-cad基因的相對表達(dá)量。如果結(jié)果大于1,表示T-cad基因的表達(dá)水平在膀胱癌組高于參考值,即為高表達(dá);如果結(jié)果小于1,表示T-cad基因的表達(dá)水平在膀胱癌組低于參考值,即為低表達(dá)。分析血清T-cad mRNA的表達(dá)水平與膀胱癌患者性別、臨床分期、病理分級的關(guān)聯(lián)性。

1.2.3建立T-cad過表達(dá)EJ1細(xì)胞系 實(shí)驗(yàn)分3組,空白對照組(Control)、空載組(Vector,不含T-cad序列的空載對照組)、T-cad過表達(dá)組(T-cad-OE)。T-cad過表達(dá),首先將T-cad CDS序列克隆到 pLVX IRES載體,使用Lipofectamine 2 000將載體和病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EJ1細(xì)胞;48 h后收集病毒上清液,通過0.45 μM過濾器過濾,0.8 μg·mL-1Polybrene與細(xì)胞共孵育48 h;然后向培養(yǎng)基中加入200 μg·mL-1嘌呤霉素用于培養(yǎng)細(xì)胞1 w后,進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力 取1 000個(gè)對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中24 h后進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn);將CCK8試劑盒中試劑原液稀釋至實(shí)驗(yàn)使用濃度;從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板,棄掉孔板中培養(yǎng)基;每孔加入100 μL稀釋后的CCK8工作液,放入培養(yǎng)箱中孵育1 h后,將上清轉(zhuǎn)移至新的96孔板中,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 將500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,放入培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)2 w,每4 d更換1次培養(yǎng)基。2 w后從培養(yǎng)箱中取出6孔板,吸出培養(yǎng)基并棄掉,使用PBS緩沖液清洗。加入4%多聚甲醛室溫固定15 min后棄掉固定液,然后加入1 ml結(jié)晶紫溶液室溫染色10 min,棄掉結(jié)晶紫溶液,加入清水清洗并室溫條件下晾干,待完全晾干后,計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.6Western blot 法檢測相關(guān)信號分子表達(dá) 收集細(xì)胞,加入200 μl RIPA裂解液 4℃裂解 30 min;4℃,12 000 g離心15 min后收集上清并使用BCA法檢測蛋白濃度。加200 μl Loading Buffer并放入金屬域中100℃加熱5 min;將丙烯酰胺凝膠放入電泳槽中并加入適量電泳液,加入20 μg蛋白樣;80 V穩(wěn)壓進(jìn)行電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),關(guān)閉電源進(jìn)行轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn),100 V穩(wěn)壓進(jìn)行轉(zhuǎn)印80 min。將PVDF膜完全浸泡在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育封閉1 h。然后將PVDF膜放入一抗(T-cad、EGFR、PI3K p110α、p-AKT、GAPDH)中過夜孵育;次日,取出PVDF膜,TBST緩沖液清洗后,將PVDF膜放入稀釋好的二抗中室溫孵育1 h;TBST緩沖液清洗后,將PVDF膜完全浸泡在配制好的ECL發(fā)光液中,使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

實(shí)踐民俗學(xué)需要關(guān)注個(gè)人敘事，這不僅是深入了解當(dāng)?shù)厝说囊螅沂莿?chuàng)新民俗志書寫和研究范式的要求。我們有必要從實(shí)證的民俗志書寫理念轉(zhuǎn)到對話與交流的民俗志書寫理念上來。

2 結(jié)果

2.1 T-cad在膀胱癌患者和對照組人群中轉(zhuǎn)錄水平差異

結(jié)果表明,膀胱癌患者血液中T-cad mRNA表達(dá)水平低于對照組,對照組血清中T-cad mRNA水平是膀胱癌組的2.8倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),如圖1所示。

圖1 膀胱癌組與對照組人群血清中T-Cad mRNA表達(dá)水平

2.2 T-cad mRNA的表達(dá)水平與膀胱癌患者一般特征及臨床特征的關(guān)聯(lián)性

結(jié)果表明,2組患者在年齡、性別、腫瘤分期方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病理分級為G1的8例患者,其中2例低表達(dá),6例高表達(dá);病理分級為G2～G3的32例有21例低表達(dá),11例高表達(dá)。T-cad低表達(dá)和高表達(dá)兩組患者在腫瘤病理分級方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見表1。

表1 T-cad mRNA表達(dá)水平與膀胱癌患者一般特征和臨床特征的關(guān)系

2.3 T-cad過表達(dá)EJ1細(xì)胞系中T-cad的表達(dá)

圖2 T-cad轉(zhuǎn)染后表達(dá)

2.4 T-cad過表達(dá)后EJ1細(xì)胞增殖能力變化

結(jié)果如圖3(A)所示:與對照組和Vector組相比,T-cad過表達(dá)組EJ1細(xì)胞活力減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),表明T-cad過表達(dá)可抑制EJ1細(xì)胞增殖能力。結(jié)果如圖3(B)顯示,與對照組和Vector組相比,T-cad過表達(dá)組EJ1細(xì)胞系克隆形成數(shù)量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明T-cad過表達(dá)可抑制EJ1細(xì)胞的克隆形成能力。

圖3 過表達(dá)T-cad對EJ1細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響

2.5 T-cad過表達(dá)對EGFR-PI3K-AKT信號軸的影響

Western blot結(jié)果顯示:與空白對照組和Vector組相比,過表達(dá)T-cad組EJ1細(xì)胞EGFR表達(dá)水平下調(diào),表達(dá)量約為對照組的60%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);同時(shí),PI3Kα和p-AKT相對表達(dá)水平也下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖4。

圖4 過表達(dá)T-cad后相關(guān)信號分子表達(dá)

3 討論

膀胱癌具有易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、5年生存率低以及易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[10-12]。鈣黏蛋白家族是一類細(xì)胞間黏附分子,主要分布于各種上皮組織,介導(dǎo)異型細(xì)胞間的黏附。T-cad基因位于染色體16q24,由于它在許多不同的癌癥中經(jīng)常被沉默,因此長期以來一直被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子[13]。本研究通過對比膀胱癌患者與對照組人群血清中T-cad mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),膀胱癌患者血清中T-cad表達(dá)水平低于對照組,說明膀胱癌的發(fā)生與T-cad的表達(dá)降低有關(guān)。為探討T-cad的表達(dá)水平是否與膀胱癌的進(jìn)展和惡性程度有關(guān),本研究進(jìn)一步分析了T-cad mRNA與膀胱癌分期、病理分級之間的關(guān)系。在本研究中發(fā)現(xiàn),T-cad的表達(dá)水平影響膀胱癌的病理分級,T-cad表達(dá)水平較低的膀胱癌病理分級較高,腫瘤惡性程度較高,但其中的具體機(jī)制尚不清楚。

有研究證實(shí),T-cad是皮膚鱗狀細(xì)胞癌中EGFR通路活性的輔助負(fù)調(diào)節(jié)劑。T-cad通過影響EGFR的膜區(qū)室化來調(diào)節(jié)EGFR通路活性;T-cad上調(diào)促進(jìn)EGFR在脂筏中的保留,而T-cad沉默從該隔室釋放EGFR,使EGFR更容易受到配體刺激[14-15]。EGFR是受體酪氨酸激酶(Rtk)家族成員之一,可以激活PI3K-AKT信號通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明,在低分期膀胱癌(Ta)中,約20%患者表現(xiàn)出EGFR的上調(diào),而在高分期膀胱癌(≥T2)中,約有高達(dá)50%的患者都表現(xiàn)出EGFR表達(dá)的上調(diào)[16],可見EGFR在誘導(dǎo)膀胱癌進(jìn)展中的重要性。本研究中制備了T-cad過表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株(EJ1),通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)探究T-cad過表達(dá)對EJ1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T-cad過表達(dá)抑制EJ1細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力。進(jìn)一步探究EGFR-PI3K-AKT信號軸相關(guān)信號分子的表達(dá)變化,結(jié)果表明T-cad過表達(dá)抑制EJ1細(xì)胞EGFR、PI3Kα、p-AKT的表達(dá)。

綜上,T-cad通過抑制EGFR的活性從而抑制PI3K-AKT信號通路,抑制膀胱癌的發(fā)生;而T-cad的表達(dá)降低,使其喪失對EGFR的抑制作用,導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。