TLR9啟動子區基因多態性與柯薩奇病毒A16感染手足口病患兒的相關性研究

鄭晨晨,散 琴,王字卉

(湖北省十堰市婦幼保健院 檢驗科,湖北 十堰442000)

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一類腸道病毒(enterovirus,EVs)感染引起的傳染性疾病,兒童是該病的易感人群,引發手足口病的腸道病毒有多種(型),其中以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CoxA16)最為常見。隨著近幾年EV71型滅活疫苗的接種,EV71感染的兒童手足口病占比減少。雖然Cox A16病毒感染后大部分患兒臨床癥狀較輕,但是發病率較高,引起越來越多的關注[1-2]。Cox A16感染的患兒臨床表現輕重不一,輕癥者僅為發熱、皮疹、口腔黏膜散在皰疹等,重癥者可出現中樞神經系統損害、心肺功能衰竭等[3-4],Cox A16病毒感染的發病機制至今沒有完全闡明,可能與其感染導致的異常免疫反應有關[5-6]。機體的天然免疫系統在抗感染過程中發揮重要功能,它通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別具有病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),快速啟動機體的免疫反應從而抵抗病原微生物的進一步感染[7-9]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是模式識別受體(PPRs)的一種,TLR具有單個的跨膜的蛋白,可識別來源于微生物的具有保守結構的PAMP分子,是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[10-11]。有研究認為,TLR基因多態性與多種病毒的免疫激活過程密切相關,并對患者病情預后有一定的影響[12-13]。本研究旨在探索Cox A16感染兒童手足口病患者外周血IL-6、IFN-α水平及其與Toll樣受體9基因多態性的相關性,為Cox A16型手足口病的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2018年4月至2021年10月湖北省十堰市婦幼保健院收治的Cox A16病毒感染的兒童手足口病患者201例為實驗組,納入標準:(1)患兒肛拭子標本Cox A16核酸檢測為陽性,診斷參照2018年版《手足口病診療指南》[14]。(2)入院前患兒無藥物治療史。排除標準:(1)患兒合并其他的病毒感染所致疾病。(2)患兒有自身免疫缺陷癥疾病或者先天性疾病。根據患兒是否出現中樞神經系統并發癥,將實驗組分為輕癥組(158例)和重癥組(43例),對照組為132名健康兒童。本研究通過十堰市婦幼保健院倫理委員會審查,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及材料IL-6、IFN-α測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,TLR9測定試劑盒購自上海安為生物科技有限公司、DNA提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,PCR試劑盒購自購自寶生物工程(大連) 有限公司,總RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒及實時熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)均購自寶生物大連公司,低溫離心機購自Thermo Scientific公司,PCR儀購自Bio-Rad公司,DYY-6C電泳儀購自北京六一儀器廠,引物設計及合成購自上海生工生物工程公司,凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1標本的采集及處理 收集納入患者的年齡、性別等一般資料,于患者入院24 h內采集患者外周血3 ml于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)真空抗凝管,混勻,離心(3 000 r/min)10 min,分離血漿和細胞,-80℃低溫冰箱保存備用。

1.3.2IL-6、IFN-α水平的測定 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血漿中的白細胞介素-6(IL-6)、α干擾素(IFN-α)水平,測定的方法嚴格按照Biorbyt公司產品試劑盒說明書進行操作。

1.3.3TLR9、IL-6、IFN-αmRNA相對表達量的檢測 按照試劑盒說明書提取樣本的外周血提取總RNA。分光光度計檢測RNA濃度及A260 /A280,A260/A280介于1.8～2.0,應用SYBR GreenⅠ染料法的實時熒光PCR技術檢測TLR9、IL-6、IFN-αmRNA的相對表達量,內參基因為β-actin,引物由上海生物技術有限公司設計合成。從樣本的外周血提取的總RNA,逆轉錄為cDNA,然后以cDNA作為模板進行PCR擴增,根據SYBR Premix Ex TaqTM 試劑盒說明書進行操作。PCR擴增條件:95℃預變性5 min,95℃變性5 s、58℃退火15 s、72℃延伸15 s,共39個循環。相對基因表達分析采用2-ΔΔCt法,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參)對照組。

1.3.4TLR9基因多態性的檢測 按照DNA快速抽提試劑盒說明進行操作,快速抽提全血基因組DNA,NanoDrop分光光度計檢測提取樣本的吸光度值,A260/A280介于1.6～1.8,將提取的樣本DNA于-80℃低溫冰箱保存,采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RELP)技術對TLR9基因多態性的檢測分析,上下游引物見表1。PCR擴增條件:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環30次,之后72℃延伸5 min。PCR擴增產物用限制性內切酶酶進行酶切,酶切產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,然后通過Bio-Rad凝膠成像系統觀察結果,判斷樣本的基因型。

表1 TLR9 rs352140、rs164640、rs187084引物序列

2 結果

2.1 各組一般資料比較對照組、輕癥組、重癥組在性別、年齡方面比較無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 各組間一般資料比較

2.2 各組研究對象TLR9、IL-6、IFN-α mRNA表達水平Cox A16病毒感染的手足口病患兒TLR9 mRNA、IL-6 mRNA及IFN-αmRNA相對表達水平均高于對照組(P<0.05),且重癥組手足口病患兒的上述mRNA表達水平均高于輕癥組,差異具有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 各組研究對象TLR9、IL-6、IFN-α mRNA 相對表達水平

2.3 各組研究對象炎性因子TLR9、IL-6、IFN-α表達水平Cox A16病毒感染的手足口病患兒炎性因子TLR9、IL-6及IFN-α表達水平均高于對照組(P<0.05),且重癥組手足口病患兒的上述因子表達水平均高于輕癥組,見表4。

表4 各組研究對象炎性因子TLR9、IL-6、IFN-α表達水平

2.4 TLR9基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率的比較TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084 位點的SNPs的預期基因型頻率均處于哈迪-溫伯格平衡(HWE;P>0.05);各研究組在rs352140、rs164640位點的基因型和等位基因分布差異不明顯(P>0.05),但rs187084的基因型和等位基因分布存在顯著差異(P<0.05),其中對照組及輕癥組手足口病患兒的C等位基因分布頻率明顯低于重癥組(P<0.05),見表5。TLR9基因rs187084位點PCR-RFLP電泳圖譜,見圖1。

圖1 TLR9基因rs187084位點PCR-RFLP電泳圖譜

表5 各組TLR9基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率的比較

Lane1為TC基因型(356 bp、209 bp、147 bp);Lane2、Lane4為TT基因型(209 bp、147 bp);Lane3、Lane5為CC基因型(356 bp)

2.5 二元Logistic回歸分析TLR9基因rs187084位點基因型與兒童手足口病的相關性共顯性模型中,CC基因型人群是TT基因型人群患病風險的2.552倍(OR=2.552,P<0.05);顯性模型中,TC+CC基因型人群是TT基因型人群患病風險的1.997倍(OR=1.997,P<0.05);隱形模型中,CC基因型人群是TT+TC基因型人群患病風險的1.824倍(OR=1.824,P<0.05)。見表6。

表6 Logistic回歸分析TLR9基因rs187084位點與Cox A16型手足口病的關系

3 討論

Cox A16病毒感染的發病機制至今沒有完全闡明,有學者[15-16]認為,可能與Cox A16感染后導致的異常免疫反應和免疫損傷有關。TLR具有單個的跨膜的蛋白,是參與天然免疫的重要分子。研究表明[17-18],TLR9途徑可觸發NF-κB信號通路的活化,進而釋放炎性介質如干擾素IFN-α及IL-6等,IFN-α、IL-6是重要的炎性介質,二者與感染密切相關,其表達情況受基因水平、轉錄水平及轉錄后水平的調控[19]。

本研究結果顯示,Cox A16病毒感染的手足口病患兒TLR9、IL-6、IFN-α的mRNA表達水平和炎性因子蛋白表達水平均高于對照組,且重癥組手足口病患兒高于輕癥組患兒,差異具有統計學意義。表明在Cox A16病毒感染過程中,炎癥反應在手足口病的進展中有著重要的作用,TLR9、IL-6、IFN-α可能是Cox A16感染由輕癥進展成重癥的關鍵因子。通過進一步研究TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084單核苷酸多態性發現,TLR9基因rs352140、rs164640位點基因型分布及等位基因分布差異均無統計學意義,rs187084基因位點基因型及T、C等位基因分布比較差異具有統計學意義,且對照組及輕癥組手足口病患兒的C等位基因分布率明顯低于重癥組,進一步用二元Logistic回歸統計分析,結果表明rs187084位點CC基因型是兒童手足口病Cox A16感染的獨立危險因素,CC基因型人群是TT基因型人群患病風險的2.552倍,是TT+TC基因型人群患病風險的1.824倍,表明TLR9基因rs187084位點基因多態性與Cox A16型手足口病存在較大關聯。但本研究納入的病例樣本較少,且并未進行多因素的分層分析,后續還有待增加樣本量,同時進一步探索不同因素對TLR9基因多態性與Cox A16感染手足口病相關性的影響。

綜上所述,TLR9、IL-6、IFN-α參與Cox A16型手足口病的過程,并可能是Cox A16感染由輕癥進展成重癥的關鍵因子,且TLR9基因在rs187084位點的基因多態性與Cox A16型手足口病存在較大關聯。