三七總皂苷調控miR-1231保護高糖下腎小球系膜細胞的研究

田 昕,單婉鑫,石 艷,王陸飛*

(1.吉林大學第二醫院,吉林 長春130041:2.吉林大學藥學院,吉林 長春130021)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是由糖尿病引發的腎臟功能損害,此病已逐漸成為危害程度極大的糖尿病微血管并發癥之一[1]。腎小球系膜細胞(mesangial cells,MCs)是腎小球內極其活躍的細胞,腎小球系膜細胞異常增殖并伴隨著胞外基質的大量合成是DN的早期主要病理特征之一,且DN與炎癥反應密切相關[2]。MicroRNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中,在基因調控中發揮重要作用。研究表明,miRNA在腎小球疾病中也扮演著重要的角色。一些miRNAs在腎小球肥大和腎小球系膜細胞增殖中起到了調節作用[3-4]。三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)為五加科中藥材三七的主要活性成分,具有預防和治療糖尿病腎病的作用,具體機制尚不明確。本課題組前期通過microRNA芯片技術預測出三七總皂苷可恢復高糖引起的人腎小球系膜細胞中miR-1231的下調,為DN的防治提供了新的思路。本研究旨在研究PNS對高糖誘導下HMCs增殖的影響以及從microRNA的角度來探討PNS對DN分子水平上的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM低糖培養基、DMEM高糖培養基(普諾賽生命科技有限公司,武漢),胎牛血清(賽百慷生物技術股份有限公司,上海),胰蛋白酶(翌圣生物科技股份有限公司,上海),三七總皂苷(南京景竹生物科技有限公司),TransScript反轉錄反應體系One-Step gDNA Removal(北京全式金生物技術股份有限公司),hsa-miR-1231(金開瑞生物工程有限公司),IL-6、TNF-α一抗購于上海碧云天生物技術有限公司,GAPDH 一抗及二抗購于ABclonal,ECL底物發光顯色試劑盒購于上海威奧生物科技有限公司。CO2培養箱(日本松下公司),Strata-gene實時熒光定量PCR儀(博日科技有限公司),TG16-W臺式高速冷凍離心機(英泰儀器有限公司,長沙),SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉膜設備(美國Bio-Rad公司)。

1.2 HMCs的復蘇、培養及分組液氮中取出細胞凍存管,在37 ℃水浴鍋中1 min解凍。加4 mL的DMEM低糖培養液(10%胎牛血清、1%雙抗)1 000 rpm離心5 min,棄上清。加入2 mL DMEM低糖完全培養基吹散細胞,再加入8 mL DMEM低糖完全培養基。將其混合后,移到25 cm2的培養皿中,于5% CO2,37℃下孵育24 h,之后更換培養基,并繼續培養。將HMCs分為空白對照組(CON),高糖組(HG)和三七總皂苷組(PNS)。

1.3 CCK-8法檢測各組HMCs增殖能力選擇3～5代的HMCs,胰酶消化離心,按照每個孔3×103個的細胞將細胞懸液接種到96孔板中,每孔加200 μL,每組平行設6個復孔。邊緣孔用無菌PBS填充。分別經5.6 mM D-葡萄糖(CON)、30 mM D-葡萄糖(HG)的培養液和6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的三七總皂苷處理24 h,向每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于培養箱內孵育1～4 h。在酶聯免疫檢測儀上選定450 nm波長,利用空白對照孔調零,再測得各組的吸光度(OD)值。

1.4 Real-time PCR法檢測miR-1231表達采用全式金EasyPure○RmiRNA Kit試劑盒提取microRNA,紫外分光光度計檢測A260/A280在1.8和2.0之間的RNA純度,逆轉錄采用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒,采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix進行Real-time PCR。反應結束后,計算機分析并計算終產物的融解曲線,采用2-ΔΔCt方法分析相關基因的表達水平。

1.5 miR-1231靶基因預測及功能和信號通路分析對miR-1231進行靶基因的初級篩選,采用以下microRNA靶基因數據庫TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)進行預測分析,并采用Cytoscape軟件將miR-1231與靶基因的調節網絡可視化作圖分析。以GeneOntology和KEGG數據庫對所確定的靶基因進行功能富集及信號通路的可視化分析。

1.6 ELISA法檢測PNS對HMCs中TNF-α、IL-6分泌情況的影響用0.05 mol/L pH為9.6的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板反應孔中加100 μL溶液,4 ℃過夜。次日棄去孔內溶液,再用PBS洗滌3次,每次3 min。細胞上清液300 g離心10 min,立即檢測。加稀釋好的待測樣品100 μL于上述孔中,37℃孵育1 h后洗滌。每孔加入100 μL酶標抗體(現配現用),37 ℃孵育1 h后洗滌。每孔加入100 μL TMB底物溶液(現配現用),37 ℃孵育30 min。孵育完成后,向每個孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應。在ELISA檢測儀上設定檢測波長為450 nm,用空白對照孔調零后測定各孔的OD值。

1.7 Western blot法檢測炎癥因子蛋白表達水平提取各組細胞蛋白,應用BCA蛋白定量試劑盒檢測以上各樣本蛋白濃度,用微量進樣器吸取20 μL蛋白樣品,注入梳孔內。用80 V恒壓電流電泳到蛋白樣品到達層積膠與分離膠界限處時,立即切換至120 V恒壓電泳。設定200 mA恒流轉膜1 h,將凝膠條帶轉至PVDF膜上,轉膜結束后將PVDF膜放入TBST中在搖床上晃動1 min,以洗去殘余轉膜液,再將膜浸入5%脫脂奶粉中封閉,孵育1～2 h。4 ℃過夜,回收一抗,TBST洗3×15 min。再加入稀釋好的二抗,室溫孵育1 h,TBST洗3×15 min。將 ECL發光底物 A液和 B液以1∶1的比例混合在一起,并在整個 PVDF膜上均勻地鋪滿,反應1 min,使用 Tanon 4200化學發光成像系統進行曝光和顯影。應用Image-Pro Plus 6.0分析各組條帶的灰度值,統計結果。

1.8 統計學方法SPSS19.0軟件分析統計數據,所有數據用平均數±標準差表示,組間差異用方差分析進行統計學檢驗,組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測三七總皂苷對高糖下HMCs增殖的抑制作用與CON組相比,HG組細胞OD值顯著升高(P<0.01);與HG組相比,各個濃度的三七總皂苷組OD值均顯著降低(P<0.05)。結果表明,三七總皂苷對高糖環境誘導的細胞過度增殖的抑制作用具有一定的濃度依賴性,50 μg/mL的三七總皂苷已經能顯著降低高糖環境引起的細胞增殖,細胞OD值已降低到與CON組相近水平,所以本實驗選用50 μg/mL的三七總皂苷進行后續的實驗(圖1)。

圖1 三七總皂苷對高糖誘導下HMCs增殖的影響

2.2 Real-time PCR法檢測三七總皂苷對高糖下HMCs miR-1231的調控作用與CON組相比,HG組miR-1231顯著下調(P<0.01),與HG組相比PNS組miR-1231表達量顯著上升(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-1231的含量測定

2.3 miR-1231靶基因預測及通路富集采用Targetscan數據庫對miR-1231進行靶基因預測,發現miR-1231的靶基因有IGF1、TMED1、GSTT2等(圖3)。以KEGG數據庫對miR-1231的靶基因進行信號通路分析,發現與miR-1231相關的通路有Parathyroid hormone synthesis、secretion and action、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、MAPK signaling pathway等。用Cytoscape軟件將排列前20的信號通路可視化(圖4)。由信號通路氣泡圖可知,MAPK signaling pathway所形成的原點最大,pvalue值最小,說明MAPK signaling pathway與miR-1231密切相關(圖5)。以GeneOntology對miR-1231的靶基因進行生物功能富集可知,miR-1231的靶基因參與調控腎小球系膜細胞內蛋白質轉運、轉錄輔助抑制因子結合等生物學功能(圖6)。

圖3 miR-1231靶基因預測

圖4 信號通路網絡圖

圖5 信號通路氣泡圖

圖6 生物學功能分析

2.4 三七總皂苷對高糖下HMCs炎癥的抑制作用采用ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6的含量,HG組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平較CON組顯著升高(P<0.01),PNS組較HG組相比TNF-α、IL-6含量均顯著降低(P<0.01)(圖7)。采用Western blot法針對炎癥因子的蛋白表達進行了檢測,結果表明,HG組細胞中TNF-α、IL-6蛋白表達水平較CON組顯著升高(P<0.01),PNS組較HG組相比TNF-α、IL-6蛋白表達量顯著降低(P<0.01)(圖8)。

圖7 各組細胞炎癥因子分泌情況

圖8 HMCs內TNF-α、IL-6蛋白表達情況

3 討論

DN是一種糖尿病腎小球硬化癥,具有遺傳因素、高血糖等誘因,是一種伴有血管損傷和腎小球血流動力學變化的腎小球代謝紊亂綜合征。DN狀態下,腎小球病變主要包括系膜細胞肥大、基底膜增厚和系膜基質增生等。MCs是DN極其重要的靶細胞,持續的高糖環境能夠誘發其異常增殖以及炎癥反應的發生[5-6]。PNS是從中藥材三七中提取的主要活性成分,其具有擴張血管、增強微循環、抗炎、抗氧化、抗休克、抗腫瘤等功能[7-8]。目前PNS已被證實具有腎臟保護作用,減緩糖尿病腎病的發展[9],但其機制尚不明確。

本實驗采用CCK-8法探究了三七總皂苷對HMCs的增殖的影響,發現三七總皂苷可以抑制高糖誘導的細胞過度增殖,且其抑制作用具有濃度依賴性,并選用50 μg/mL的三七總皂苷進行后續實驗。

miRNA是各種細胞活動的強大調節劑,調控著細胞的生長、分化、發育和凋亡。miRNA也被證明可以在與糖尿病發生發展相關的組織中發揮作用,包括胰腺、骨骼肌和脂肪組織[10]。近年來,在糖尿病腎病中,miRNA具有靶向炎癥、纖維化、氧化應激等作用[11]。已有報道證明miRNA通過介導炎癥來調節糖尿病腎病[12]。

在前期實驗中,通過microRNA芯片分析預測出三七總皂苷可上調高糖下HMCs內miR-1231的表達,但三七總皂苷是否通過調控miR-1231實現對高糖下HMCs的保護作用尚不明確。

有研究表明,miR-1231可調控腫瘤細胞的發展[13-14]。但miR-1231對于DN及高糖下腎小球系膜細胞的作用未有文獻報道,通過Real-time PCR法結果發現,PNS可恢復高糖引起的HMCs miR-1231的下調。對miR-1231進行了生物信息學分析,預測到miR-1231的靶基因有IGF1、TMED1、GSTT2等;且通過KEGG通路富集以及GO分析,得到miR-1231與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相關。研究發現,MAPK信號通路可以通過激活NF-κB轉錄因子來調節炎癥因子的表達。在炎癥過程中,炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達水平會升高,而MAPK信號通路的激活可以促進這些炎癥因子的表達[15-16]。PNS被證實對多種實驗性炎癥模型具有良好的抗炎活性。在本實驗中,采用ELISA和Western blot法對炎癥因子的表達量進行了檢測,發現PNS可顯著抑制高糖下HMCs中TNF-α和IL-6的高表達,起到良好的抗炎作用。

綜上所述,三七總皂苷可通過上調miR-1231的表達有效地改善高糖引起的HMCs過度增殖,并起到一定的抗炎作用。