APOC3表達(dá)抑制劑篩選模型的構(gòu)建及意義

劉思辰,鄭麗華,柯 超*

(1.中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 廣州510060;2.東北師范大學(xué) 藥物基因和蛋白篩選國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130117)

人載脂蛋白C3(Apolipoprotein C3,APOC3)是富含甘油三酯(TG)的脂蛋白(Triglyceride rich lipoproteins,TRLs)及高密度脂蛋白的主要成分,在調(diào)節(jié)血漿甘油三酯水平中起重要作用,與血漿TG水平呈正相關(guān),含有APOC3的高密度脂蛋白與頸動(dòng)脈斑塊的形成、缺血性腦卒中和腦梗死、癡呆和大腦中β-淀粉樣蛋白沉積等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[1-3]。研究顯示,APOC3可直接促進(jìn)單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,引起炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)脂代謝相關(guān)疾病——?jiǎng)用}粥樣硬化的發(fā)生[4]。以上研究提示,下調(diào)APOC3的表達(dá)可能是治療脂代謝異常疾病的有效途徑之一。因此,本研究釣取了APOC3的啟動(dòng)子,構(gòu)建了APOC3表達(dá)抑制劑篩選模型,并從中藥單體化合物中篩選APOC3表達(dá)抑制劑,之后鑒定了化合物對(duì)APOC3表達(dá)的抑制作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

用于篩選的中藥小分子化合物購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度均在98%以上,用DMSO溶液配成10 mg/mL的母液,儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。進(jìn)行篩選時(shí),用DMSO稀釋成5 μg/mL的工作液進(jìn)行使用。抗APOC3(ab21032)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,抗GAPDH抗體購(gòu)自上海康成生物有限公司,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、兔IgG均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。人氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)購(gòu)自廣州奕源生物技術(shù)公司,油紅O購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

人胚腎細(xì)胞HEK 293T、人正常肝細(xì)胞L02購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù),由本實(shí)驗(yàn)室保留和凍存。DNA提取試劑盒購(gòu)自常州百代生物科技股份有限公司。

1.2 pAPOC3-luc質(zhì)粒的構(gòu)建

收集培養(yǎng)好的L02細(xì)胞用PBS洗滌后,按廠家提供的說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA,之后以L02細(xì)胞基因組DNA為模板,用特異性引物對(duì)APOC3啟動(dòng)子(-1 451～+39 bp)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列如下:上游:5’-GGGGTACCGAGGAATTCCAAGTCTC-3,下游:5’-CCCAAGCTTGGGCATTACCTGGAGCAG-3。回收PCR片段,將該片段和pGL2-Basic載體分別用KpnⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切,之后分別回收片段和載體,用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,之后涂布于Amp+LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,次日挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌,之后提取質(zhì)粒,電泳鑒定后送去測(cè)序公司測(cè)序。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞系L02和人胚腎細(xì)胞HEK 293T培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,置于恒溫37℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

準(zhǔn)備2支1.5 mL離心管,其中1管加入100 μL CaCl2溶液,同時(shí)將2.5 μg質(zhì)粒DNA加入并混勻。另1管加入100 μL BBS溶液,將混好質(zhì)粒的CaCl2溶液分?jǐn)?shù)次加入BBS溶液中,邊加邊吹打混勻。室溫靜置20 min,隨后將混合液加入到待轉(zhuǎn)細(xì)胞孔中,輕搖培養(yǎng)板混勻。培養(yǎng)4 h后,棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液,加入完全培養(yǎng)基。

1.5 APOC3表達(dá)抑制劑的篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293T細(xì)胞,用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染pAPOC3-luc質(zhì)粒,4 h后,消化細(xì)胞,以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染24 h后,棄去培養(yǎng)液,加入終濃度為5 μg/mL的中藥單體化合物(用完全培養(yǎng)基稀釋),對(duì)照為等體積的DMSO稀釋液(用完全培養(yǎng)基稀釋),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè),篩選可明顯抑制APOC3啟動(dòng)子活性的單體化合物。

1.6 熒光素酶活性檢測(cè)

以24孔板培養(yǎng)的細(xì)胞為例,將各孔細(xì)胞分別收集到1.5 mL離心管中,離心,棄上清。每管加入500 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,4℃離心,棄上清。每管加入100 μL細(xì)胞裂解液,-20℃靜置20 min,取出后室溫溶解,4℃離心,上清即為細(xì)胞裂解液。在96孔熒光素檢測(cè)白板中加入5 μL熒光素酶活性分析緩沖液,并加入45 μL細(xì)胞裂解液,混勻,隨后加入100 μL熒光素反應(yīng)液,立即放入BMG熒光化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中,啟動(dòng)程序檢測(cè)活性。

1.7 千層紙素A(Oroxylia A,OA)對(duì)APOC3 mRNA表達(dá)的影響

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種5×105個(gè)/孔的L02細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,加入15 μg/mL的OA,對(duì)照組用等體積的DMSO處理,24 h后,棄去培養(yǎng)基。用TRIzol法提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)操作將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master,按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。用PikoReal SW-software version 2.0(Thermo Fisher Scientific)分析結(jié)果。每個(gè)樣品進(jìn)行至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),以β-actin為內(nèi)參,進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。PCR 引物如下,APOC3-F:5’-AGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAG-3’,APOC3-R:5’-CACGGCTGAAGTTGGTCTGACCTCA-3’;β-actin-F:5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,β-actin-R:5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’。

1.8 OA對(duì)APOC3蛋白表達(dá)的影響

在6孔板中培養(yǎng)L02細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入15 μg/mL的OA,對(duì)照組用等體積的DMSO稀釋液代替,作用細(xì)胞24 h后,提取蛋白,并按比例加入4×蛋白上樣緩沖液,于100℃孵育10 min。制備聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠和5%壓縮膠),在每個(gè)上樣孔中加入10 μL制備好的蛋白樣品,上層膠80 V恒壓電泳30 min,下層膠120 V恒壓電泳1 h。電泳結(jié)束后將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,恒壓100 V轉(zhuǎn)印2 h。取出PVDF膜,洗滌后放入封閉液中,搖床上室溫振蕩封閉1 h。棄去封閉液,洗滌后將PVDF膜放入已預(yù)先加入對(duì)應(yīng)抗體的稀釋液中,4℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗滌后將膜用二抗室溫?fù)u床孵育1 h。最后使用ECL顯影,凝膠成像儀成像。

1.9 油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)沉積

將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的L02細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上,培養(yǎng)24 h后,建模組加入80 mg/mL oxLDL溶液,化合物組加入80 mg/mL oxLDL溶液的同時(shí)加入15 μg/mL的OA,對(duì)照組用等體積的DMSO稀釋液代替。24 h后洗滌蓋玻片,加4%細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30 min,加入油紅O染色液(加的體積覆蓋住板底即可),室溫放置10 min,用真空泵吸去染色液,用60%異丙醇漂洗脫色,除去多余的染料,迅速用真空泵吸去,甘油封片,于顯微鏡下觀察拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次以上。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法為兩組比較用雙尾t-Test法,3組以上比較用one way ANOVA;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pAPOC3-luc熒光素梅報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

以L02細(xì)胞的基因組DNA為模板,用特異性引物對(duì)APOC3啟動(dòng)子區(qū)域(-1 451～+39 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將擴(kuò)增片段用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示,1號(hào)泳道1 500 bp左右的位置可以看到一條清晰的條帶,與設(shè)計(jì)釣取的APOC3啟動(dòng)子片段大小基本一致。

圖1 APOC3啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

隨后根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物中加入的酶切位點(diǎn)KpnⅠ和HindⅢ對(duì)釣取的片段和目的載體pGL2-Basic進(jìn)行雙酶切。隨后回收酶切片段進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化入DH5α菌株。挑取單克隆菌落,過(guò)夜培養(yǎng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化菌,并提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖2所示,與pGL2-basic質(zhì)粒條帶位置相比,重組質(zhì)粒的條帶位置明顯滯后,疑似已連接入目的片段。之后送上海生工測(cè)序,結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pAPOC3-luc中的啟動(dòng)子活性分析

為了檢測(cè)所釣取的啟動(dòng)子是否具有活性,在HEK 293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入pGL2-basic或pAPOC3-luc質(zhì)粒,48 h后檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性。結(jié)果如圖3所示,轉(zhuǎn)入pAPOC3-luc的細(xì)胞其熒光強(qiáng)度明顯高于轉(zhuǎn)入pGL2-basic的細(xì)胞。

2.3 抑制APOC3表達(dá)的中藥單體化合物的篩選

將前面所構(gòu)建的pAPOC3-luc轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞中,24 h后分別加入中藥單體化合物繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示,化合物OA對(duì)APOC3基因的啟動(dòng)子活性有明顯的抑制效果。

圖4 OA對(duì)APOC3啟動(dòng)子活性的影響

2.4 OA對(duì)APOC3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)了OA對(duì)L02細(xì)胞中APOC3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)15 μg/mL OA作用24 h后,L02細(xì)胞中APOC3的mRNA(圖5)和蛋白表達(dá)水平(圖6)均明顯下降。

圖5 Real-time RT-PCR法檢測(cè)OA對(duì)APOC3 mRNA表達(dá)的影響

圖6 OA對(duì)APOC3蛋白表達(dá)的影響

2.5 OA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響

用80 mg/mL oxLDL誘導(dǎo)L02細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)oxLDL可以增加肝細(xì)胞中脂質(zhì)的累積,而OA則對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積有一定的抑制作用(見(jiàn)圖7)。

圖7 OA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的L02細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響

3 討論

APOC3 作為脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL) 抑制劑,可通過(guò)抑制脂肪酶、肝脂酶、膽固醇脂卵磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶的活性影響脂代謝,在調(diào)節(jié)脂代謝過(guò)程中具有十分重要的作用[5-6]。APOC3 基因缺失,或 APOC3 基因靶向斷裂,或APOC3對(duì)LPL的抑制作用降低,都可導(dǎo)致血漿甘油三酯降低,因?yàn)長(zhǎng)PL是TRLs分解代謝的關(guān)鍵酶,所以減少對(duì)LPL的抑制,就會(huì)加強(qiáng)脂解作用,加速TRLs分解,對(duì)抗HTG,從而對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)[7-8]。反之,APOC3 基因在實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá),則明顯促進(jìn) As 的形成和發(fā)展[9]。

APOC3 作為載脂蛋白家族中的主要成員,其重要性已日益引起科學(xué)界的重視,隨著對(duì) APOC3 生物學(xué)活性及作用機(jī)制的深入研究,發(fā)現(xiàn)APOC3 很可能會(huì)成為預(yù)防、治療代謝綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心腦血管疾病等的新靶點(diǎn)[10-11]。

本研究通過(guò)基因重組技術(shù),將APOC3的啟動(dòng)子片段克隆到熒光素酶報(bào)告載體pGL2-basic上,構(gòu)建了由APOC3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞,利用APOC3的啟動(dòng)子活性驅(qū)動(dòng)下游熒光素酶的表達(dá),通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷APOC3啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。基于該原理對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的300多種中藥單體化合物進(jìn)行篩選,最后篩選到了OA,發(fā)現(xiàn)它可以有效抑制APOC3的啟動(dòng)子活性,并進(jìn)一步在mRNA和蛋白水平上確定其可以抑制APOC3的表達(dá)。

千層紙素 A 是從中藥黃芩中提取的黃酮類(lèi)化合物,其有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗凝血、促進(jìn)新生血管生成等多種生物學(xué)活性[12]。本研究發(fā)現(xiàn),其具有抑制APOC3表達(dá)的作用,并可抑制細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積。