辣椒生長(zhǎng)素抑制蛋白基因CaARP1的克隆及其對(duì)青枯菌侵染的響應(yīng)

劉艷艷　丁穎　劉興華　鄭佳秋

摘要：生長(zhǎng)素響應(yīng)基因編碼生長(zhǎng)素抑制蛋白（ARP），是非常重要的下調(diào)基因，能夠抑制生長(zhǎng)素（IAA）信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、抗病、抗逆以及種子休眠等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為解析辣椒ARP1基因的序列特征和功能，以辣椒品種CM334為試材，克隆獲得辣椒ARP1基因cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CaARP1，GenBank登錄號(hào)為AAR83888.1。序列分析結(jié)果表明，辣椒CaARP1基因的cDNA全長(zhǎng)228 bp，沒(méi)有非翻譯區(qū)，包含1個(gè)228 bp的開放閱讀框架，編碼75個(gè)氨基酸。CaARP1基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)385 bp。CaARP1蛋白的分子量為8.298 ku，理論等電點(diǎn)為9.99，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，不存在信號(hào)肽，為親水性不穩(wěn)定蛋白，二元結(jié)構(gòu)元件多為無(wú)規(guī)則卷曲。CaARP1蛋白與同屬茄科植物的馬鈴薯、番茄、黃果茄、煙草生長(zhǎng)素抑制蛋白的同源性較高，序列一致性分別為95.00%、96.67%、93.24%、91.89%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，CaARP1基因在青枯菌侵染1～7 d期間均呈現(xiàn)極顯著下調(diào)的趨勢(shì)，推測(cè)該基因可能在辣椒應(yīng)答青枯病侵染中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：辣椒；CaARP1基因；基因克隆；序列分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S641.301；S436.418.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）21-0013-06

植物可以通過(guò)多種抗病途徑抵御環(huán)境中眾多病原菌的侵染，但抗病性的建立會(huì)以減慢植物生長(zhǎng)為代價(jià)，如植物受到病菌侵染時(shí)，則減弱生長(zhǎng)信號(hào)通路，激活防衛(wèi)反應(yīng)上游的基因或轉(zhuǎn)錄因子來(lái)抵御病原物侵染；在無(wú)病菌侵害時(shí)，使抗病信號(hào)通路處于非激活狀態(tài)來(lái)關(guān)閉抗病途徑，植物生長(zhǎng)不受抑制［1-2］。生長(zhǎng)素作為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)分子，通過(guò)與受體組織器官結(jié)合來(lái)激活生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程和對(duì)疾病等的防御過(guò)程［3-4］。生長(zhǎng)素應(yīng)答基因主要包括受生長(zhǎng)素信號(hào)激活表達(dá)的生長(zhǎng)素激活基因和受生長(zhǎng)素信號(hào)抑制的生長(zhǎng)素抑制基因［5-8］，其中生長(zhǎng)素抑制基因主要包括生長(zhǎng)素抑制蛋白（auxin repressed protein，ARP）基因和休眠相關(guān)蛋白（dormancy related protein，DRM）基因［5］，二者密切相關(guān)，一起形成ARP/DRM基因家族。

人們對(duì)生長(zhǎng)素的研究主要集中在受生長(zhǎng)素信號(hào)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因上［9-11］，如ARF、SAUR等，然而關(guān)于受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)的基因卻研究較少［12-14］，如生長(zhǎng)素抑制蛋白基因，該基因是在抑制生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用的下調(diào)基因，能夠參與下游基因的表達(dá)調(diào)控。生長(zhǎng)素抑制蛋白除了可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和調(diào)控植物激素生長(zhǎng)素變化［13，15-16］，也在植物應(yīng)答病原菌中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中miR393基因被誘導(dǎo)后，生長(zhǎng)素受體蛋白TIR1被下調(diào)，生長(zhǎng)素信號(hào)的傳遞受到抑制，生長(zhǎng)素合成發(fā)生改變，低量的生長(zhǎng)素提高了生長(zhǎng)素抑制基因的表達(dá)［17］。蘇盼盼在感病和抗病水稻品種中接種稻瘟病病菌，發(fā)現(xiàn)抗病品種中OsARP1和其他3個(gè)生長(zhǎng)素抑制蛋白同源基因?qū)Φ疚敛〔【捻憫?yīng)較感病品種中的更為敏感，與感病品種相比，抗病品種中 OsARP1被誘導(dǎo)表達(dá)的速度更快，效率更高［18］。但是，在已有的研究中極少見到辣椒ARP1對(duì)青枯菌產(chǎn)生生理響應(yīng)及抗性機(jī)制的報(bào)道。

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種栽培范圍廣、經(jīng)濟(jì)效益高且深受人們喜愛的茄科蔬菜，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位［19］。而在大田生產(chǎn)過(guò)程中，夏季高溫高濕的氣候和種類繁多的土傳病害病原菌共存的環(huán)境成為了辣椒長(zhǎng)期演化過(guò)程中的選擇壓力。在這種選擇壓力下，辣椒很可能會(huì)進(jìn)化出一套精細(xì)復(fù)雜的抗青枯病和耐高溫高濕脅迫的機(jī)制［20］。然而，目前對(duì)辣椒抗青枯病的機(jī)制研究的報(bào)道依然較少，因此挖掘抗青枯病相關(guān)基因和研究抗青枯病機(jī)制對(duì)培育抗青枯病辣椒品種具有重要意義。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期利用RNA-seqs技術(shù)分析了辣椒在青枯菌侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制蛋白CaARP1的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了持續(xù)下調(diào)的趨勢(shì)。因此，本研究通過(guò)克隆獲得辣椒APR1基因cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)該基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)確認(rèn)了CaARP1在青枯菌侵染下下調(diào)表達(dá)的特征，為進(jìn)一步解析CaARP1在辣椒青枯侵染過(guò)程中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

本研究以辣椒品種CM334為試驗(yàn)材料，由福建農(nóng)林大學(xué)遺傳改良中心提供。試驗(yàn)時(shí)間為2021年6月至2023年5月，試驗(yàn)地點(diǎn)為福建農(nóng)林大學(xué)遺傳改良中心。青枯菌處理：本試驗(yàn)使用灌根法［21］接種辣椒植株，準(zhǔn)備青枯菌菌體，懸浮于經(jīng)高壓滅菌的雙蒸水中，D595 nm調(diào)至0.8（濃度為1.0×108 CFU/mL），并倒入育苗瓶進(jìn)行接種處理，接種辣椒苗置于28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，分別在接種后1、3、5、7 d收集辣椒莖基部往上2 cm莖段用于RNA提取。

1.2 辣椒總RNA提取及cDNA的合成

使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取辣椒幼苗葉片總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM RT-PCR Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，作為基因克隆的模板。

1.3 辣椒CaARP1基因的克隆

以辣椒全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//peppersequence.genomics.cn）為參考，對(duì)辣椒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)UniGene注釋結(jié)果CaARP1基因全長(zhǎng)序列，并設(shè)計(jì)基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ARP-F：5′-gctaagagagaagATGGTGTTGATTGATAAACTTTGGG-3′；ARP-sma I-R：5′-gcccttgctcaccatcccgggTGATGCTTAGATCTGGTGTTCCC-3′，以辣椒葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用柱式膠回收試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到辣椒CaARP1基因的cDNA序列。

1.4 CaARP1基因的生物信息學(xué)分析

利用ORF finder軟件在線分析CaARP1的開放閱讀框架，并預(yù)測(cè)其編碼蛋白的氨基酸序列。利用ExPASy ProtParam分析辣椒CaARP1蛋白的理化性質(zhì)；利用NCBI上的CDD分析辣椒CaARP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)辣椒CaARP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用ProtScale預(yù)測(cè)辣椒CaARP1蛋白的親疏水性；利用TMHMM 2.0和SignalP 5.0分別預(yù)測(cè)辣椒CaARP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽；利用PSORT預(yù)測(cè)辣椒CaARP1蛋白的亞細(xì)胞定位。利用ClustalX 2.0軟件比對(duì)辣椒CaARP1及NCBI上下載的其他物種同源ARP的氨基酸序列，并用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（bootstrap=1 000）。各生物學(xué)信息分析軟件網(wǎng)址詳見表1。

1.5 CaARP1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青枯菌灌根處理后0、1、3、5、7 d辣椒CaARP1基因的表達(dá)量。根據(jù)CaARP1基因的序列設(shè)計(jì)定量PCR引物，CaARP1-Fq：CAAACTCCGAAAGAGCCTCTCT和CaARP1-Rq：TCATGATGCTTAGATCTGGTGT；內(nèi)參基因CaActin的引物為CaActin-F：TTGGATTCTGGTGATGGTGTG和CaActin-R：AACATGGTTGAGCCACCACTG。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［21］。每個(gè)樣品重復(fù)3次，使用2-△△CT法分析結(jié)果［22］。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，結(jié)果保存成“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaARP1基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

辣椒CaARP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，在230 bp左右有單一條帶，測(cè)序后獲得辣椒ARP1基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為CaARP1，GenBank登錄號(hào)為AAR83888.1。該基因cDNA片段全長(zhǎng)228 bp，沒(méi)有非翻譯區(qū)，包含1個(gè)228 bp的開放閱讀框架，編碼75個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2 辣椒CaARP1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因結(jié)構(gòu) 將辣椒CaARP1基因的cDNA序列與DNA序列進(jìn)行比對(duì)（圖3）后發(fā)現(xiàn)，在基因組水平上，CaARP1基因含有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)385 bp。

2.2.2 理化性質(zhì) 在NCBI上進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)將CaARP1蛋白含有1個(gè)Auxin_repressed結(jié)構(gòu)域，位于第20～72個(gè)氨基酸位置，是一種生長(zhǎng)素抑制蛋白。CaARP1蛋白的理化性質(zhì)：預(yù)測(cè)其分子式為C366H563N109O111S1，原子總數(shù)為1 150，相對(duì)分子質(zhì)量為8.298[KG*3]ku，含有75個(gè)氨基酸。CaARP1蛋白的理論等電點(diǎn)為9.99，含有帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）5個(gè)，帶正電荷殘基（Arg+Lys）9個(gè)，脂肪系數(shù)為44.13，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定指系數(shù)為44.95，是一種堿性不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 辣椒CaARP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白由3種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成，包括占比6.67%的α-螺旋、22.67%的延伸鏈和70.67%的無(wú)規(guī)則卷曲（圖4-A）。利用SWISS-MODEL軟件構(gòu)建辣椒CaARP1蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果見圖4-B，空間結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，含有部分α-螺旋和延伸鏈，同二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本上一致。

2.2.4 疏水性 根據(jù)ProtScale軟件預(yù)測(cè)CaARP1蛋白親疏水性，結(jié)果顯示該蛋白在第34個(gè)氨基酸處出現(xiàn)最大值，為0.344，疏水性最強(qiáng)； 在第70個(gè)氨基酸處出現(xiàn)最小值，為[KG*5]-3.022，親水性最強(qiáng)（圖5）。

該蛋白親水性平均值為-0.924，推測(cè)其為一種親水性蛋白。

2.2.5 信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域 通過(guò)SiganalP 5.0軟件分析辣椒CaARP1蛋白信號(hào)肽序列，結(jié)果表明，該蛋白未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白屬于非分泌蛋白。通過(guò)在線生物軟件TMHMM 2.0預(yù)測(cè)辣椒CaARP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白沒(méi)有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，是一種非跨膜蛋白質(zhì)。

2.2.6 亞細(xì)胞定位 利用PSORT對(duì)辣椒CaARP1蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明CaARP1蛋白最可能被定位于細(xì)胞核（60.9%），其次是線粒體（26.1%），再次是分泌系統(tǒng)囊泡（4.3%）、過(guò)氧化物酶體（4.3%）、細(xì)胞質(zhì)（4.3%）等。

2.2.7 同源性與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 NCBI在線通過(guò)Blastp將CaARP1基因推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已經(jīng)登錄的黃果茄AAS75891.1（Solanum virginianum）、煙草AAS76635.1（Nicotiana tabacum）、歐白英XP_055805508.1（S. dulcamara）、馬鈴薯XP_006347006.1（S. tuberosum）、彭氏番茄XP_015068255.1（S. pennellii）、喜馬拉雅鳳仙花XP_047328583.1（Impatiens glandulifera）、胡桃XP_018858854.1（Juglans regia）、歐洲油菜XP_013734249.1（Brassica napus）、蘿卜KAJ4891583.1（Raphanus sativus）、牡丹ABW74471.1（Paeonia suffruticosa） 、阿月渾子X(jué)P_031278964.1 （Pistacia vera） 、番茄NP_001307367.1（S. lycopersicum）、牛奶子AAC62104.2（Elaeagnus umbellata）、牽牛XP_019175658.1（Ipomoea nil）等植物的ARP氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)辣椒CaARP1氨基酸序列與這些物種的ARP氨基酸序列的一致性分別為93.24%、91.89%、90.54%、95.00%、81.82%、80.00%、71.83%、69.01%、71.43%、65.00%、83.02%、96.67%、71.83%、88.00%，相似性較高，均達(dá)到60%以上，N端和C端的氨基酸序列高度保守（圖6）。

由圖7可知，同屬茄科植物的馬鈴薯、番茄、黃果茄、煙草的ARP蛋白處于同一分支，具有較高的同源性，其中馬鈴薯和番茄的ARP蛋白與辣椒CaARP1的同源性最高，親緣關(guān)系最近。辣椒CaARP1與十字花科歐洲油菜和蘿卜ARP蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CaARP1基因在青枯菌處理下的表達(dá)分析

參與植物防御反應(yīng)的基因在病原菌侵染過(guò)程中往往表現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)或抑制表達(dá)的趨勢(shì)。為了推測(cè)CaARP1基因在辣椒應(yīng)答青枯菌侵染中的可能功能，本研究分析了其在青枯菌侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平變化情況。本研究使用灌根的方法在辣椒根部接種青枯菌，在接種后1、3、5、7 d收集莖基部（青枯菌大量繁殖的主要組織）提取總RNA。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了CaARP1的表達(dá)水平，由圖8可知，接種1 d后 CaARP1轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了極顯著下調(diào)的趨勢(shì)，該趨勢(shì)持續(xù)到了接種后7 d。以上結(jié)果暗示著CaARP1在辣椒應(yīng)答青枯菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

3 討論與結(jié)論

對(duì)于生長(zhǎng)素信號(hào)的識(shí)別、合成及代謝相關(guān)蛋白基因表達(dá)調(diào)控，需要很多基因的參與。在煙草中通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)素抑制基因NtARP1沉默和過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，NtARP1基因是調(diào)節(jié)煙草生長(zhǎng)和抗病的重要因子［23］。Park等的研究表明，黑刺槐生長(zhǎng)素抑制蛋白R(shí)pARP編碼基因表達(dá)與植株生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)生長(zhǎng)素含量高時(shí)，其表達(dá)量就降低，植株表現(xiàn)為生長(zhǎng)［24］，Zhao等的研究表明，煙草生長(zhǎng)素抑制蛋白NtARP1可激活細(xì)菌蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)［23］。

辣椒是茄科植物的典型代表。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，利用RNA-seqs技術(shù)分析了辣椒在青枯菌侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制蛋白CaARP1的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了持續(xù)下調(diào)的趨勢(shì)，本研究使用熒光定量PCR技術(shù)確認(rèn)了CaARP1在青枯菌侵染下下調(diào)表達(dá)的特征。大量研究表明，植物在遭受到病原菌侵染的過(guò)程中，可暫時(shí)性地通過(guò)關(guān)閉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而通過(guò)驅(qū)動(dòng)免疫相關(guān)基因的表達(dá)激活植物防御反應(yīng)，對(duì)病原菌的入侵作出積極響應(yīng)，該策略可以幫助植物在有效的資源情況下，合理調(diào)控基因的表達(dá)，保證植物生長(zhǎng)和防御之間的平衡［25-28］。CaARP1編碼蛋白在青枯菌侵染下出現(xiàn)了持續(xù)下調(diào)的趨勢(shì)，筆者推測(cè)在青枯菌侵染辣椒過(guò)程中，病原菌通過(guò)直接或者間接的方式抑制生長(zhǎng)抑制蛋白CaARP1的轉(zhuǎn)錄水平，解除CaARP1對(duì)辣椒生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)了辣椒的生長(zhǎng)并通過(guò)某些機(jī)制關(guān)閉寄主的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)其侵染的目的，具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步解析。

本研究以辣椒品種CM334為研究材料，成功克隆了辣椒CaARP1基因cDNA全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為 228 bp，包含一個(gè)228 bp的開放閱讀框架，編碼75個(gè)氨基酸。CaARP1蛋白為堿性親水性非分泌蛋白，與番茄同源性最高、親緣關(guān)系最近。CaARP1蛋白分子量為8.298 ku，理論等電點(diǎn)為9.99，帶正電荷和負(fù)電荷的氨基酸數(shù)分別為9、5個(gè)。該蛋白最可能位于細(xì)胞核，無(wú)規(guī)則卷曲在預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比最大。CaARP1基因在青枯菌處理后的表達(dá)量呈現(xiàn)了持續(xù)下調(diào)的趨勢(shì)，暗示該基因很可能在辣椒應(yīng)答青枯病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。后期的研究可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因和病毒誘導(dǎo)基因沉默研究CaARP1蛋白在辣椒應(yīng)答青枯菌中的功能。

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收稿日期：2023-08-18

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（21）3031］；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制專項(xiàng)（編號(hào)：PZCZ201715）。

作者簡(jiǎn)介：劉艷艷（1990—），女，山東日照人，碩士，助理研究員，主要從事作物抗逆育種研究。E-mail：1052233980@qq.com。

通信作者：鄭佳秋，碩士，副研究員，主要從事辣椒抗逆育種研究。E-mail：nky8236@163.com。