乙蒜素和嘧菌酯及其復配劑對4種病原真菌的室內毒力測定

李文靜　任立瑞　方文生　靳茜　顏冬冬　李園　王秋霞　曹坳程

摘要：為明確乙蒜素和嘧菌酯對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）和刺盤孢屬（Colletotrichum spp.）4種病原真菌的毒力效果，同時擴大乙蒜素的防治譜，篩選新的殺菌劑組合物，為枯萎病和立枯病等植物病害的防治提供更多的選擇，在室內離體條件下，使用菌絲生長速率法先測定了乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的作用效果，并得到相應的毒力回歸方程。結果表明，80%乙蒜素乳油對4種病原真菌的EC50分別為15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對4種病原真菌的EC50分別為13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L。隨后在室內離體條件下采用 Colby法進一步評價乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的混用效果，結果表明，乙蒜素和嘧菌酯混合使用對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原真菌表現出加成的作用效果。最后，對乙蒜素和嘧菌酯部分混配組合進行室內離體葉片試驗，進一步驗證乙蒜素和嘧菌酯的混配效果，結果表明，與單獨使用乙蒜素或嘧菌酯相比，乙蒜素和嘧菌酯混合使用對病原菌的防治效果顯著增加。這一試驗結果表明乙蒜素和嘧菌酯復配能夠擴大殺菌劑的防治譜，同時也篩選出了新的殺菌劑組合，為多種病害的科學防治提供更為有效的藥劑使用參考。

關鍵詞：乙蒜素；嘧菌酯；病原菌；Colby法；復配；增效

中圖分類號：S481+.9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0113-06

乙蒜素是一種有機硫類殺菌劑，是我國在1960年研制成功的一種植物源農藥新品種。它具有高效、廣譜、無公害的特點，能抑制多種真菌和細菌的生長繁殖，而且它的成本和價格與其他殺菌劑相比較低。因此乙蒜素是一種極具市場潛力的殺菌劑，具有良好的發展前景。對乙蒜素的研究主要集中于病原菌的室內毒力測定及田間防效［1-4］、乙蒜素與其他藥劑的復配效果和乙蒜素抑制菌株生長作用的機制等［5-10］。乙蒜素可有效抑制水稻、棉花、玉米、西瓜、黃瓜等多種作物上的病害，例如水稻稻瘟病、棉花立枯病、玉米大小斑病、西瓜蔓枯病、黃瓜苗期綿疫病等。

嘧菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類農藥，它能夠有效地抵御多種病害，包括白粉病、銹病、網斑病、霜霉病和稻瘟病等，其作用范圍極其廣泛，且抗病能力強［11］。

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）主要會引起植物的枯萎病，如黃瓜枯萎病、番茄枯萎病等；立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）容易引起作物的立枯病和根腐病，如番茄立枯病、棉花立枯病和黃瓜立枯病等；新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）會導致植物葉斑病和根腐病，如草莓葉斑病和根腐病等；刺盤孢屬（Colletotrichum spp.）會引起植物的炭疽病，如大白菜炭疽病等。

嘧菌酯對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原菌的毒力均有相關報道［12-18］；乙蒜素對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和刺盤孢屬3種病原菌的毒力均有相關報道［19-21］，而對新擬盤多毛孢的毒力目前沒有相關報道。

抗藥性的產生會導致藥劑防效降低，因此不能長期使用某一藥劑防治這些病害。鑒于此，為擴大殺菌劑的防治譜、篩選殺菌劑新組合、更有效地防治多種病害，本研究在室內離體條件下使用菌絲生長速率法測定乙蒜素和嘧菌酯及其復配劑對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原菌的毒力；進一步采用Colby法評價乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的混用效果，并選擇其中較好的處理組合進行離體葉片試驗，目的是為了獲得新型、高效、低毒的藥劑組合，為病害的科學防治提供更多的藥劑使用參考，并為新的復配藥劑的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試藥劑見表1。

1.2 供試培養基及菌株

供試PDA培養基成分：馬鈴薯浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 14.0 g，pH值為5.6 ± 0.2。以1 L蒸餾水為例，稱取39.0 g PDA培養基，攪拌加熱至完全溶解，分裝于100 mL錐形瓶中，121 °C高壓滅菌15 min，備用。

供試菌株：尖孢鐮刀菌采集自北京市昌平區金六環基地的黃瓜病株，病原菌的分離純化在實驗室中進行，并將其儲存在PDA斜面上于4 ℃冰箱中保存備用，經鑒定，該病菌為尖孢鐮刀菌；立枯絲核菌采集自北京市順義區的番茄病株，分離純化方法同上，經鑒定，該病菌為立枯絲核菌；新擬盤多毛孢采集自河北省保定市草莓種植基地（連續種植草莓20年以上）的草莓根腐病樣本，分離純化方法同上，經鑒定為新擬盤多毛孢［22］；刺盤孢屬采集自湖南省百合病株，分離純化方法同上，經鑒定，該病菌為刺盤孢屬。所有菌株均在筆者所在實驗室保存。

1.3 試驗時間及地點

試驗時間：2021年5—11月；所有試驗均在筆者所在實驗室完成。

1.4 試驗方法

1.4.1 乙蒜素和嘧菌酯對4種菌株的毒力測定 使用菌絲生長速率法測定4種病原真菌對乙蒜素和嘧菌酯的敏感性。如表2所示，每種藥劑設置5個濃度。本試驗均在無菌環境下進行：首先，配制一系列濃度梯度的含藥PDA平板；其次，從活化菌落的邊緣取1個直徑為5.0 mm的菌餅，菌絲面朝下，每皿接種1個菌餅，注意打孔器打在同一圓周上；再次，對照不加藥劑但加等量蒸餾水，其他操作均同上，每個處理重復3次；最后，于28 ℃培養箱中倒置培養，4～7 d后測量菌落直徑，并計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率的計算公式如下：

抑制率=（對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）/（對照菌落平均直徑-菌餅直徑）×100%。

1.4.2 Colby法評價藥劑混用效果 根據得到的乙蒜素和嘧菌酯的毒力回歸方程，2個藥劑各選取2個合適的濃度（本研究以理論EC50和EC70為例），共4個藥劑混配組合進行混配。操作方法同“1.4.1”節，計算不同濃度混配藥劑對4種菌株的存活率和理論存活率的影響。

存活率=[1-（處理菌落直徑平均值-菌餅直徑）/（對照菌落直徑平均值-菌餅直徑）]×100%；

E0＝X1·X2·…·Xn／100（n-1）。

其中：E0為混劑的理論存活率；n為混用殺菌劑的數量；Xn為施用第n種殺菌劑后菌株的存活率。E為混劑使用后實際存活率，當E0-E＜-5%時，表明存在拮抗作用；當-5%≤E0-E≤5%時，表明存在加成作用；當E0-E＞5%時，表明存在增效作用［23-24］。

1.4.3 離體葉片法評價藥劑混用效果 選擇Cobly法中乙蒜素與嘧菌酯復配得到的較好的處理組合，采用離體葉片法進一步驗證乙蒜素和嘧菌酯復配對立枯絲核菌的防治效果。于黃瓜葉片背面均勻噴灑配制好的藥液，待藥液自然風干后，將各處理葉片葉背向上，放置于培養皿中保濕，其中對照處理只含蒸餾水不含藥劑，每個處理8張葉片，重復3次。將直徑為5.0 mm的菌餅接種于葉片背面。接種完成后置于人工氣候箱，在28 ℃、相對濕度為65%的條件下培養7 d。

防效計算公式如下：

病情指數=0×A+1×B+3×C+5×D+7×E+9×F/調查總葉片數×9×100；

防治效果=1-處理組平均病情指數/對照組平均病情指數×100%。

其中，A、B、C、D、E、F分別代表各級葉片數，詳見表3。

1.5 數據處理

利用SPSS、Excel和DPS軟件處理試驗數據，得到各藥劑對供試菌株的EC50、毒力回歸方程的斜率、卡方值和P值。使用單因素方差分析，對離體葉片的病情指數進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 4種病原菌菌株對單劑藥劑的室內毒力

乙蒜素對4種菌株的室內毒力試驗結果（表4）表明，80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢、刺盤孢屬4種菌株的EC50分別為15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L，其中對尖孢鐮刀菌和新擬盤多毛孢的EC50較小，表明80%乙蒜素乳油對它們的抑制效果較好；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對4種菌株的EC50分別為13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L，其中250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制效果較好，相比于其他菌株，對立枯絲核菌的EC50最大，說明250 g/L嘧菌酯懸浮劑對立枯絲核菌的抑制效果最差。

2.2 Colby法對乙蒜素和嘧菌酯混用效果的評價

2.2.1 乙蒜素和嘧菌酯混用對尖孢鐮刀菌的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌的抑制率為30%～50%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對尖孢鐮刀菌的抑制率為40%～50%，各濃度組合對尖孢鐮刀菌的抑制率在60%～75%之間。Colby法檢驗結果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對尖孢鐮刀菌的聯合作用類型屬于加成作用（圖1-a）。

2.2.2 乙蒜素和嘧菌酯混用對立枯絲核菌的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對立枯絲核菌的抑制率為35%～100%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對立枯絲核菌的抑制率為36%～60%，各濃度組合對立枯絲核菌的抑制率在57%～100%之間。Colby法檢驗結果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對立枯絲核菌的聯合作用類型屬于加成作用（圖1-b）。

2.2.3 乙蒜素和嘧菌酯混用對新擬盤多毛孢的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對新擬盤多毛孢的抑制率為52%～68%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對新擬盤多毛孢的抑制率為45%～56%，各濃度組合對新擬盤多毛孢的抑制率在76%～98%之間。Colby法檢驗結果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對新擬盤多毛孢的聯合作用類型屬于加成作用；其中乙蒜素濃度為40 mg/L，嘧菌酯濃度為 12.5 mg/L 時混用，對新擬盤多毛孢的抑菌效果增效明顯（圖1-c）。

2.2.4 乙蒜素和嘧菌酯混用對刺盤孢屬的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對刺盤孢屬的抑制率為77%～84%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制率為46%～80%，各濃度組合對刺盤孢屬的抑制率在94%～99%之間。Colby法檢驗結果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對刺盤孢屬的聯合作用類型屬于加成作用；其中乙蒜素濃度為 32 mg/L，嘧菌酯濃度為0.04 mg/L時混用，對刺盤孢屬的抑菌效果增效明顯（圖1-d）。

2.3 離體葉片法對乙蒜素和嘧菌酯混用效果評價

2.3.1 對尖孢鐮刀菌的活性 對乙蒜素與嘧菌酯復配中得到的增效效果較好的組合進行黃瓜葉片離體試驗，評價乙蒜素與嘧菌酯復配對尖孢鐮刀菌的防治效果。試驗結果（表5，圖2-a）表明，乙蒜素與嘧菌酯復配后防治效果顯著增加。單獨使用濃度為5 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為37.18%，單獨使用濃度為16 mg/L的乙蒜素時，防治效果為33.33%，但兩者混配使用時，防治效果可達57.69%；單獨使用濃度為5 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為37.18%，單獨使用濃度為40 mg/L的乙蒜素時，防治效果為53.85%，但兩者混配使用時，防治效果可達78.21%，這表明乙蒜素與嘧菌酯復配后對尖孢鐮刀菌的離體防控效果顯著增加。

2.3.2 對立枯絲核菌的活性 對乙蒜素與嘧菌酯復配中得到的增效效果較好的組合進行黃瓜葉片離體試驗，評價乙蒜素與嘧菌酯復配對立枯絲核菌的防治效果。試驗結果（表5，圖2-b）表明，乙蒜素與嘧菌酯復配后防治效果顯著增加。單獨使用濃度為100 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為17.50%，單獨使用濃度為32.00 mg/L的乙蒜素時，防治效果為21.25%，但兩者混配使用時，防治效果可達60.00%；單獨使用濃度為100 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為17.50%，單獨使用濃度為 53.33 mg/L 的乙蒜素時，防治效果為72.50%，但兩者混配使用時，防治效果可達83.75%，這表明乙蒜素與嘧菌酯復配后對立枯絲核菌的離體防控效果顯著增加，這與室內試驗結果一致。

3 結論與討論

在實際生產中，為避免長期使用單一藥劑產生抗藥性，常常將多種藥劑混用來延緩抗藥性并提高防效［25］。研究表明，藥劑混配具有一定的增效作用，同時可以降低藥劑使用量和使用次數，從而降低藥劑使用成本［26-27］。嘧菌酯是一種高效、廣譜的殺菌劑，乙蒜素也具有高效、廣譜、無公害的特點，兩者作用機制不同，且無交互抗性。嘧菌酯可以與多種藥劑進行復配，但目前乙蒜素與嘧菌酯復配僅在防治番茄黃葉枯萎病方面有過報道，可參考性不足［28］。

本研究測定了乙蒜素和嘧菌酯及其復配劑對4種病原真菌的室內毒力。單一藥劑試驗結果表明，80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌和新擬盤多毛孢的抑制效果較好，其EC50分別為15.507、15.991 mg/L；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制作用極好，其EC50為0.023 mg/L，嘧菌酯在用量極低的情況下對刺盤孢屬就可以達到極好的效果。與單劑相比，乙蒜素和嘧菌酯復配使用對4種病原真菌的抑制作用均有一定程度的增加，復配藥劑的效果顯然更好。離體葉片試驗結果表明，與單一藥劑相比，乙蒜素與嘧菌酯的混合使用顯著提高了對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的防治效果。

本試驗進行了乙蒜素與嘧菌酯單劑及其復配劑對4種病原真菌的室內毒力測定，二者對4種病原真菌均具有良好的抑制作用，且復配劑的抑菌效果優于單劑。這一試驗結果表明乙蒜素與嘧菌酯復配能夠擴大殺菌劑的防治譜，同時也篩選出了新的殺菌劑組合，為多種病害的科學防治提供了更為有效的藥劑參考，并為開發防治相關病害復配藥劑提供了重要的理論依據和科學支撐。但本試驗為室內離體試驗結果，田間使用效果尚不明確，有待于進一步深入研究。

參考文獻：

［1］柳自清，張博然，顧愛星. 幾種殺菌劑對棉花枯萎病的田間防效評價［J］. 農業與技術，2021，41（9）：21-26.

［2］鄒東霞，鐘雅婷，廖旺姣，等. 9種殺菌劑對桉樹輪斑病原菌室內毒力測定［J］. 廣西林業科學，2021，50（2）：189-194.

［3］邱 月，李海燕，張海洋，等. 不同藥劑對水稻惡苗病病菌的抑制作用［J］. 中國植保導刊，2020，40（11）：69-72.

［4］林天然，盧藝惠，曾文龍，等. 常見殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力效應［J］. 農學學報，2020，10（8）：33-37.

［5］李小艷，劉翊澤，楊 紅，等. 不同藥劑對擬莖點霉菌的室內毒力測定［J］. 現代農業科技，2020（22）：70-73.

［6］武向文，沈慧梅，沈雁君，等. 不同種子處理藥劑對水稻惡苗病的控制效果［J］. 中國植保導刊，2021，41（4）：66-68.

［7］朱秀紅，季 遠，徐 飛. 三種浸種劑對水稻浸種的安全性試驗及對水稻惡苗病預防效果評價［J］. 農業開發與裝備，2021（1）：152-153.

［8］陳永森，李日旺，黃國弟，等. 廣西芒果樹葉片苔蘚發生情況調查及藥劑篩選試驗［J］. 植物保護，2020，46（6）：217-222.

［9］Liu T，Ren X L，Cao G Y，et al. Transcriptome analysis on the mechanism of ethylicin inhibiting Pseudomonas syringae pv. actinidiae on kiwifruit ［J］. Microorganisms，2021，9（4）：724.

［10］劉長令，關愛瑩，張明星. 廣譜高效殺菌劑嘧菌酯［J］. 世界農藥，2002（1）：46-49.

［11］白 冰. 雙流縣草莓縮蔸病診斷與防治［D］. 雅安：四川農業大學，2012.

［12］文家富，鄭小惠，陸淑靜，等. 馬鈴薯黑痣病發生與田間防治試驗［J］. 陜西農業科學，2019，65（10）：75-78.

［13］趙美鍵. 氨基寡糖素對馬鈴薯黑痣病防治效果研究［D］. 秦皇島：河北科技師范學院，2019.

［14］溫 浩，魏佳爽，張桂軍，等. 九種殺菌劑對新擬盤多毛孢病菌的室內毒力作用［J］. 農藥學學報，2019，21（4）：437-443.

［15］蘇海歡. 精油-甲氧基丙烯酸酯雜合物的設計合成及抑菌活性測定［D］. 武漢：華中農業大學，2017.

［16］謝圣華，肖彤斌，芮 凱，等. 嘧菌酯在4種瓜類真菌病害防治中的應用［J］. 熱帶農業科學，2006（2）：3-6.

［17］康立娟，韓秀英，馬志強. 嘧菌酯對三種蔬菜病害的毒力、防效及安全性研究［J］. 農藥學學報，2004（1）：85-88.

［18］吉沐祥，陳宏州，吳 祥，等. 8種生物殺菌劑對草莓枯萎病菌室內抑菌活性的測定［J］. 江蘇農業科學，2014，42（9）：103-106.

［19］李增平，張胡煥. 5種藥劑對2株立枯絲核菌的室內毒力測定［J］. 熱帶生物學報，2010，1（1）：41-44.

［20］石 潔，李寶燕，欒炳輝，等. 5種生物藥劑對葡萄炭疽病藥效研究［J］. 中國果樹，2021（1）：74-76.

［21］趙曉珍，王 荔，張 雪，等. 貴州省火龍果炭疽病病原的分離鑒定及生物農藥篩選［J］. 貴州農業科學，2020，48（4）：70-74，2.

［22］李青杰，朱佳紅，吳佳佳，等. 河北保定地區草莓根腐病病原鑒定及室內毒力測定［J］. 河北農業大學學報，2021，44（2）：15-20.

［23］Colby S R. Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations ［J］. Weeds，1967，15（1）：20-22.

［24］胡小梅，徐 進，毛連剛，等. 7種殺菌劑對姜瘟病菌Z-AQ-2菌株的抑菌活性［J］. 植物保護，2016，42（6）：208-214.

［25］杜慶志，張建業，劉 翔，等. 不同殺菌劑對小麥白粉病菌室內毒力測定及混配增效藥劑篩選［J］. 植物保護，2021，47（6）：327-331.

［26］林 輝，楊新琴，沈年橋，等. 7種藥劑防治番茄黃葉枯萎病試驗［J］. 浙江農業科學，2018，59（4）：582-583.

［27］路 妍，高 健，袁喜麗，等. 12種殺菌劑對小麥赤霉病病菌的室內毒力及不同植保器械施藥效果研究［J］. 江蘇農業科學，2021，49（21）：120-127.

［28］Zhang S M，Zhang M Q，Khalid A R，et al. Ethylicin prevents potato late blight by disrupting protein biosynthesis of Phytophthora infestans［J］. Pathogens，2020，9（4）：299-299.

收稿日期：2023-02-04

基金項目：現代農業產業技術體系北京市創新團隊項目（編號：BAIC01-2022）；河北省土傳病害綠色防控技術創新中心項目（編號：2021K04）。

作者簡介：李文靜（1999—），女，河南濮陽人，碩士研究生，主要從事殺菌劑和土壤熏蒸劑乙蒜素的應用相關研究。E-mail：wjlxhzyl@163.com。

通信作者：曹坳程，博士，研究員，主要從事土壤消毒使用技術和外來入侵植物防控研究。E-mail：caoac@vip.sina.com。