Siglecs家族分子在腫瘤中的表達與意義①

蔣奎瑩 齊莉莉 康富標 閆聰藝 王 玲

（河北醫科大學第三醫院骨與軟組織腫瘤科，石家莊 050051）

Siglecs 家族分子可在人巨噬細胞、T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等多種免疫細胞中特異性表達，參與免疫細胞活化、增殖及凋亡等多個重要的生理過程［1］。Siglecs 可通過識別腫瘤細胞表面的單糖唾液酸（Sialic acid，Sia）介導細胞間或病原體與細胞間相互作用，在免疫應答中發揮重要的調控作用，但由于腫瘤生長和增殖過程中細胞表面抗原Sia 易發生糖基化，Siglecs 與其結合后可傳遞抑制信號并調控免疫應答，進而影響腫瘤免疫微環境形成，促進腫瘤細胞發生免疫逃逸。此外，Sia-Siglec 結合后還可參與抗原提呈細胞對抗原的捕獲和提呈，影響抗原提呈細胞功能；同時腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）也促進腫瘤細胞異常分泌Sia，進而刺激浸潤免疫細胞Siglecs表達上調。Siglecs可通過誘導M2型巨噬細胞極化、改變T細胞分化方向和抑制NK 細胞殺傷活性促進腫瘤免疫逃逸。因此，腫瘤中Sia-Siglec 軸失調有助于傳遞免疫抑制信號，促進腫瘤免疫負性微環境形成，協助腫瘤細胞免疫逃逸［2］。此外，部分Siglecs分子還可傳遞激活信號，促進抗腫瘤免疫應答，增強宿主抗腫瘤功能。近年越來越多靶向Siglecs 及其配體的治療藥物已被相繼開發并進入臨床試驗，可能成為腫瘤免疫治療的新方向，本文就此進行綜述。

1 Siglecs的結構與分類

Siglecs 是一類Ⅰ型免疫球蛋白樣跨膜蛋白，由1 個胞外結構域、跨膜結構域和1 個胞內結構域組成，胞內部分為含有賴氨酸的短尾，胞外結構域由1個與N端結合的Ig結構域和不定數量的C2型結構域組成［3］。

根據Siglecs 攜帶的基序可將其分為抑制性與激活性兩種類型［4］。抑制性Siglecs分子包括Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9 和Siglec-10，其胞內區域攜帶ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）和ITIM 樣基序，并通過招募酪氨酸磷酸酶（SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP）如SHP-1和SHP-2，使其去磷酸化，傳導抑制性信號［5-6］。部分Siglecs 家族分子不含有ITIM 和ITIM樣基序，在跨膜區域攜帶1個帶正電荷的殘基，可與攜帶ITAM（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）的DAP12 相互作用產生激活胞內的信號，包括小鼠Siglec-H 及人類Siglec-4、Siglec-14、Siglec-15、Siglec-16［5，7］。

不同種類脊椎動物（如魚類、兩棲動物、鳥類、爬行動物和哺乳動物）體內均可檢出Siglecs 分子表達，根據序列保守程度，Siglecs家族又可分為經典的保守型Siglecs 分子和CD33 相關Siglecs 分子。保守型Siglecs 分子在4 億多年前就存在于古脊椎動物中，包括Siglec-1（CD169）、Siglec-2（CD22）、Siglec-4和Siglec-15，而CD33相關Siglecs分子由于基因中外顯子丟失和基因轉換等遺傳突變，形成了哺乳動物物種間分子差異［8］。因此對人和小鼠CD33 相關Siglecs 分子使用不同編號系統，人類CD33 相關Siglecs 包括Siglec-3（CD33）、Siglec-5 至Siglec-12、Siglec-14 和Siglec-16。小鼠表達的CD33 相關Siglecs分子較少，包括Siglec-3、Siglec-E、Siglec-F、Siglec-G以及Siglec-H，其中Siglec-E與Siglec-9同源，Siglec-G與Siglec-10 同源，常用于代替其同源物研究其功能［5］。

2 Siglecs在腫瘤組織中的表達

腫瘤細胞與其所處的TME 是一個功能整體，相互影響，共同進化［9］。TME主要由腫瘤細胞、各種免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞以及附近的間質細胞及各種細胞因子、趨化因子構成［10］。其中，腫瘤浸潤免疫細胞作為TME 的主要組成，參與抗腫瘤免疫應答，影響TME 免疫穩態，調控腫瘤生長、轉移，促進腫瘤發展［11］。Siglecs家族中有很多分子表達于不同腫瘤細胞表面或TME 中的免疫細胞表面，參與TME 形成與調節［12］。Siglecs 在不同腫瘤免疫細胞類型顯示出不同的表達模式，如Siglec-1 通常在單核/巨噬細胞表面表達，Siglec-9 主要表達于腫瘤相關中性粒細胞、單核細胞和NK細胞表面；Siglec-7和Siglec-9 的氨基酸序列相似性高達98%，并主要在NK 細胞表達；TME 中Siglec-10 主要在B 細胞、腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）表達，Siglec-15也主要在TAMs表達［2］。

Siglecs家族成員在多種腫瘤中均具有異常表達現象，如Siglec-1 分子在惡性黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的淋巴結巨噬細胞呈高表達［13-17］。Siglec-3 分子表達于急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）細胞表面，而在正常造血干細胞不表達，因此Siglec-3 可作為AML 治療的靶點［18］。在其他髓系細胞疾病如骨髓增生異常綜合征的異常細胞表面、急性淋巴細胞白血病的B細胞和T細胞亞群中也可檢出Siglec-3表達［19-20］。

研究發現，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、結直腸癌、黑色素瘤患者腫瘤浸潤CD8+T 細胞表面均高表達Siglec-9 分子，Siglec-9 與其配體相互作用后可抑制CD8+T細胞的細胞毒性和細胞因子產生［21-22］。NSCLC 患者中，Siglec-9+T 細胞分泌細胞因子和趨化因子的能力顯著降低，導致患者生存率下降，阻斷Sia-Siglec-9 相互作用可增強腫瘤浸潤淋巴細胞活性，成為NSCLC 的治療靶點。此外，Siglec-9的基因多態性也與肺癌和結直腸癌發病風險呈正相關［21］。

Siglec-10、Siglec-15 等在乳腺癌、結直腸癌、膀胱癌等多種腫瘤中檢測到表達，通過不同方式在TME 中發揮作用。Siglec-10 是一種抑制性受體，在卵巢癌和乳腺癌患者TME 中的TAMs 表達，且其配體CD24 在腫瘤細胞的表達也上調，通過與CD24 相互作用參與免疫調節，抑制免疫應答，促進腫瘤進展［23］。LI等［24］通過整合來自TCGA 的腫瘤樣本和來自GTEx 數據庫的正常樣本鑒定了Siglec-15 mRNA表達特征，Siglec-15 mRNA 在多數癌癥類型中表達均上調，如乳腺癌、膽管癌、食管癌、胰腺腺癌、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌等。進一步研究發現，TAMs 相關Siglec-15 可通過產生轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制CD8+T 細胞反應，促進免疫抑制性TME 形成，從而促進腫瘤免疫逃逸［25］。此外，最近研究顯示Siglec-15 通過抑制DUSP1 介導的MAPK 途徑抑制促進骨肉瘤（osteosarcoma，OS）細胞惡性進展，Siglec-15高表達與OS 肺轉移有關，并可預測OS 患者不良預后，表明Siglec-15 可能是OS 治療的新靶點［26］。總之，越來越多的證據表明Siglecs 在腫瘤組織中廣泛存在，多數通過負向調節免疫應答促進形成免疫抑制微環境和腫瘤免疫逃逸。因此，鑒于不同Siglecs分子表達譜及作用機制不同，深入研究Siglecs 在不同細胞類型上表達的不同功能，闡明Siglecs 在各種腫瘤類型中的調節機制，將為更好地開發以Siglecs家族分子為靶點進行的腫瘤免疫治療提供實驗依據。

3 Siglecs家族分子在腫瘤中的作用

3.1 Siglecs非免疫調控作用

3.1.1 Siglecs誘導細胞凋亡 CD33相關Siglecs 的一個重要功能是通過抑制增殖或誘導凋亡調節細胞生長和生存，Siglec-3在99%AML中的髓系細胞和一些淋巴亞群（包括NK 細胞）上表達［5］。VITALE等［27］用抗Siglec-3 mAb 處理AML 細胞，發現細胞凋亡早期標志物Annexin V 表達增加，與DNA 結合使雙螺旋斷裂，誘導AML 細胞凋亡，因此，Siglec-3 可用作AML 的診斷標志物和治療靶點。體外研究表明，Siglec-3 還能抑制IL-1β、TNF-α 和IL-8 等促炎細胞因子分泌，進而影響細胞增殖［28］。一些靶向Siglec-3 的抗體如gemtuzumab、ozogamicin 已被批準進入1 期臨床試驗并進行評估，但存在一定臨床毒性，目前正著力減緩其毒性反應并致力于與其他形式的免疫治療結合以增強其療效［29］。

Siglec-10 在B 細胞激活中起重要免疫調節作用，Siglec-10 及其同源物Siglec-G 分別在人和小鼠B細胞表達［30］。YIN 等［31］研究發現Siglec-G 可抑制B1細胞增殖和鈣信號轉導，并抑制轉錄因子NFATc1和NF-κB 活性，與CD24 結合后，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）相關通路，誘導B 細胞凋亡，發揮免疫抑制作用，Siglec-10 可通過此通路促進腫瘤細胞免疫逃逸。缺失Siglec-G 表達易引發B 細胞淋巴增生性疾病，如B細胞淋巴瘤/白血病［32］。Siglec-10/G是B細胞上重要的抑制性受體，Siglec-G 的抑制功能主要限于B1 細胞，影響腫瘤發展，可能成為治療白血病的新一代藥物。

3.1.2 Siglecs 促進腫瘤新生血管生成 Siglec-9 作為抑制性受體，在粒細胞、巨噬細胞、NK 細胞和T細胞表達。Siglec-9可與人類結腸癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤細胞表面的MUC1 黏蛋白結合，分泌纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等腫瘤相關因子，促進腫瘤侵襲、轉移及新生血管生成［33-35］。此外，Siglec-9 與MUC1 相互作用還可募集細胞周期相關蛋白β-catenin 并與之相互作用，使Siglec-9+樹突狀細胞表面共刺激分子、抗原提呈分子和成熟表型發生標記丟失，導致其無法作為抗原提呈細胞發揮功能，從而導致腫瘤細胞免疫逃逸［36］。Siglec-9+NK細胞高表達趨化因子受體CXCR1和CX3CR1，使IL-8 趨化傾向更顯著，而IL-8 對腫瘤增殖、侵襲及新生血管形成具有顯著促進作用［37］。

3.2 Siglecs免疫調控作用

3.2.1 Siglecs 介導抗原提呈作用 Siglec-1 主要在巨噬細胞表面表達，在巨噬細胞抗原提呈中具有重要作用，表達Siglec-1 的巨噬細胞可將死亡的腫瘤細胞抗原交叉呈遞給CD8+T 細胞，從而活化細胞毒性T細胞，促進抗腫瘤免疫應答［38］。阻斷Siglec-1會抑制小鼠CD8+T 細胞活性，影響免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷清除。DING 等［39］研究顯示，Siglec-G 缺陷小鼠通過增加樹突狀細胞表面MHCⅠ類肽復合物形成增強樹突狀細胞交叉呈遞，從而增強細胞毒性T淋巴細胞反應，抑制黑色素瘤生長。但人Siglec-1+巨噬細胞能否交叉呈遞抗原并激活T細胞應答尚不清楚。

3.2.2 Siglecs 抑制腫瘤相關T 細胞增殖活化 研究發現乳腺癌中Siglec-1+巨噬細胞與腫瘤浸潤性CD8+T 細胞數量呈正相關，更好應答新輔助化療［17］。提示Siglec-1+巨噬細胞可能是增強抗腫瘤免疫的理想靶點。

黑色素瘤中，HAAS 等［22］發現多數腫瘤浸潤CD8+T 細胞表達Siglec-9，且Siglec-9 介導的信號通路優先與SHP-1 結合，抑制CD8+T 細胞TCR 信號通路和細胞毒性等。NSCLC患者中，Siglec-9在浸潤性CD8+T 細胞上的表達與生存率降低相關，且其多態性與癌癥發生風險有關，單價Fab 片段抗體可抑制Siglec-9與其配體相互作用，增強T細胞活性［21］。

Siglec-10 可抑制TCR 介導的T 細胞活化，研究表明，在T 細胞表面表達的Siglec-10 可抑制MHCⅠ類分子和T 細胞受體相關激酶ZAP-70 磷酸化，通過ITIM 基序抑制T 細胞信號，從而抑制T 細胞活化［40-41］。此外，Siglec-10 還可與CD24 或CD52 結合，抑制TCR 相關激酶抑制T 細胞激活，促進腫瘤細胞免疫逃逸［42］。

WANG 等［43］研究證明一些腫瘤細胞表面可異位高表達Siglec-15，發現在體外Siglec-15 可抑制CD8+T細胞增殖和激活，并在Siglec15缺陷小鼠體內實驗中得到證實。小鼠黑色素瘤模型中，缺乏Siglec-15 的腫瘤細胞可促進T 細胞反應，減緩腫瘤生長，提高小鼠總生存率。此外，Siglec-15還可通過誘導TGF-β 促進調節性T 細胞分化，從而抑制T 細胞重塑免疫抑制TME［44］。人肺癌組織中，Siglec-15 和PD-L1 表達相互排斥。提示Siglec15 可能在TME 中發揮作用，有助于免疫抑制微環境形成［45］。因此，Siglec-15 可能是PD-1/PD-L1 通路外另一個免疫正常化的新靶點。對PD-1/PD-L1 抗體無反應的患者，靶向Siglec-15 可能是一種有效的替代療法。目前，雖然結束了Siglec-15 單抗NC318 治療NSCLC 和卵巢癌的1/2 期臨床試驗，但對頭頸癌（HNSCC）及三陰性乳腺癌患者的臨床試驗則繼續進行，招募表達Siglec-15 的患者并啟動2 期臨床試驗，此外，還將進行Siglec15 抑制劑與其他免疫療法聯合治療研究。

3.2.3 Siglecs 抑制NK 細胞的殺傷作用 HERNáNDEZ-CASELLES 等［46］證 明Siglec-3 通 過Vav1 信號通路導致SHP-1 分子去磷酸化，特異性拮抗DAP10 偶聯的特異性激活受體NKG2D 或2B4 介導的細胞毒性反應，在NK 細胞的細胞毒性和NKG2D/DAP10 通路中均起細胞內介質作用，進而抑制NK細胞殺傷作用。因此，Siglec-3 可作為NKG2D/DAP10 通路的抑制性受體，在針對腫瘤和感染細胞的持續免疫應答中發揮作用，保護自身細胞，并避免自身免疫。

Siglec-7 和Siglec-9 參與抑制NK 細胞在體外介導的殺傷腫瘤細胞能力，KAWASAKI 等［47］研究發現，NK 細胞的Siglec-7 分子可與腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）細胞表面表達的神經節苷脂DSGb5結合，導致NK 細胞對RCC 細胞的毒性降低。此外，Siglec-7 還與腫瘤細胞表達的神經節苷脂GD3 相互作用抑制NK 細胞的殺傷活性［48］。因此，Siglec-7 的信號傳遞是免疫檢查點之一，可作為靶點增強NK細胞抗腫瘤活性［6，49］。部分NK 細胞也表達抑制性Siglec-9。JANDUS 等［37］發現黑色素瘤、白血病患者外周血NK 細胞Siglec-9 表達上調主要發生于CD56dimCD16+亞群，該亞群NK 細胞表現出更低的細胞毒性，同時腫瘤細胞Siglec-9配體表達增加，對NK細胞殺傷的敏感性降低，阻斷Siglec-9信號后，NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用明顯增強。目前已發現唾液酸酶治療后，乳腺、腦、結腸、肝臟或淋巴組織Siglec-7高表達的腫瘤細胞對NK細胞殺傷的敏感性增強。唾液酸酶與靶向HER2抗體的體外融合增強了NK 細胞對HER2+腫瘤細胞的殺傷作用。阻斷Siglec-7 和Siglec-9 配體可增強NK 細胞介導的殺傷作用［50］。目前正在開展該靶點的藥物開發，尚處于早期研究階段，但具有一定治療潛力。

3.2.4 Siglecs 影 響TAMs 功能Siglec-1具有雙重生物學作用，在肝細胞癌體外研究中，Siglec-1+巨噬細胞可明顯增強CD8+T 細胞增殖、細胞毒性和細胞因子產生，并與更好的臨床預后相關［51］。但在三陰性乳腺癌小鼠中，乳腺癌細胞可通過激活JAK2 信號促進Siglec-1+巨噬細胞PD-L1 表達，促進腫瘤免疫逃逸。清除Siglec-1+巨噬細胞后，乳腺腫瘤和肺轉移結節微環境中CD8+T 細胞浸潤增強，抑制原位腫瘤生長和肺轉移［52］。因此，需進一步研究揭示Siglec-1+巨噬細胞在不同TME 中的復雜作用和機制及其參與調節的信號通路和關鍵細胞因子，以闡明巨噬細胞在不同腫瘤中的作用。

Siglec-9在癌癥進展過程中具有雙重功能，這取決于腫瘤生長的階段及其微環境。小鼠體內實驗證明，在腫瘤和新的轉移灶形成過程中，缺乏Siglec-E可導致一過性短暫的免疫監視增強，然而，腫瘤形成后，Siglec-E 缺陷可使TAMs 更易向促腫瘤的M2型巨噬細胞分化，從而促進腫瘤生長，清除巨噬細胞后則逆轉了這種作用，可能由于Siglec-E 配體可直接抑制促腫瘤的M2 巨噬細胞形成，并將其重新編碼成抗腫瘤表型［53］。RODRIGUEZ 等［54］研究表明，胰腺導管腺癌患者α-2，3 唾液酸表達增加并分泌TME，通過上調CD206、PD-L1 和IL-10 和IL-6 等免疫抑制因子激活Siglec-9 受體驅動單核細胞極化和分化，產生免疫抑制的TAMs，從而促進腫瘤進展和轉移。

Siglec-10 在卵巢癌和乳腺癌患者TAMs 上表達，可與腫瘤細胞表達的CD24 特異性結合。使用單克隆抗體阻斷CD24 或Siglec-10 可增強巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力，減緩腫瘤生長。當CD24 與Siglec-10 結合時，Siglec-10 招募并激活含有SH2 結構域的蛋白，尤其是SHP-1 和SHP-2，觸發信號級聯，使ITIM 區域磷酸化，從而阻斷Toll 樣受體介導的炎癥反應，激活一系列細胞內信號通路，負調控細胞內信號轉導，抑制巨噬細胞吞噬作用，促進腫瘤免疫逃逸［23］。CD24-Siglec-10 作為一種天然免疫檢查點，是介導抗腫瘤免疫的關鍵，可更好地預測哪些患者可能對治療產生反應，并為治療提供依據，目前已研發出針對CD24-Siglec-10 的藥物，并有望用于臨床治療。

人Siglec-15 在腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤巨噬細胞/髓系細胞中表達上調，而在正常組織的巨噬細胞中表達降低。Siglec-15 由M-CSF 誘導產生，能識別人類癌癥中普遍表達的Sialyl-Tn（sTn）抗原。過表達sTn 合酶的肺癌細胞與過表達Siglec-15 的THP-1巨噬細胞樣細胞共培養，M-CSF誘導M2型巨噬細胞表達Siglec-15，而在M1 型巨噬細胞則不上調，并通過DAP12-Syk 途徑產生TGF-β，促進腫瘤轉移［25］。除sTn 或相關抗原序列外，Siglec-15 與唾液酸化聚糖具有更高的親和力，推測可能在Siglec-15 的信號功能中發揮重要作用［55］。

3.2.5 Siglecs 抑制腫瘤相關中性粒細胞殺傷作用 Siglec-9陽性中性粒細胞可促進腫瘤免疫逃逸。結直腸癌體外研究顯示，Siglec-9 可誘導SHP-1 募集并抑制中性粒細胞對腫瘤細胞的殺傷，使用抗體阻斷后抑制作用減弱［56］。小鼠體內實驗中，Siglec-E缺陷小鼠中性粒細胞對腫瘤細胞的殺傷力增強，對自體腫瘤的免疫監視增強［53］。

4 小結

Siglecs 家族的作用目前仍在探索，除在腫瘤中促進免疫逃逸外，還在骨質疏松、感染性疾病、過敏反應中發揮作用，即Siglecs 與其配體相互作用可能有不同功能，取決于抑制或激活Siglecs 家族成員、其表達的免疫細胞亞群、腫瘤類型、物種以及TME中其他激活或抑制信號提供的背景。目前已逐步開展針對Siglecs 家族的腫瘤靶向免疫治療，如一些特異性抗體和人工合成的糖鏈類似物，由于TME 中的因子可調節癌細胞中唾液酸聚糖表達以及免疫細胞亞群Siglecs 表達，因此，免疫治療使用Siglecs阻斷前需進一步研究Siglecs 在多種細胞類型表達的不同功能及其促進腫瘤免疫逃逸的機制，以減少腫瘤藥物的不良反應；還可與其他方式聯合治療使其發揮協同作用，更高強度地殺死腫瘤細胞，更有效地治療腫瘤。