骨缺損修復生物材料誘導骨微環境中免疫應答機制的研究進展①

劉 瀟 李 明

（中國人民解放軍總醫院第四醫學中心骨科醫學部，國家骨科與運動康復臨床醫學研究中心，北京 100853）

骨缺損是骨科醫師面臨的臨床棘手難題，隨著近年來骨組織工程技術的迅速發展，生物材料植入成為骨缺損修復最具潛力的治療手段［1］。生物材料植入體內后，會立即引起免疫系統的異物排斥反應，植入的材料與血液相互作用在材料表面形成臨時基質，包括纖維蛋白網絡、血小板和炎癥細胞，之后由炎癥細胞觸發急性炎癥，特征為中性粒細胞或多形核白細胞的招募和激活［2-6］，多形核白細胞在降解材料的過程中會釋放蛋白水解酶和活性氧，腐蝕材料的表面，并在48 h 后迅速衰竭凋亡［7］。與此同時，部分免疫細胞被招募到生物材料中，進一步誘發宿主和局部組織的炎癥反應，這時宿主免疫系統中的單核細胞黏附于植入的生物材料表面，并分化為M1/M2 巨噬細胞［8-10］。巨噬細胞開始對生物材料進行吞噬和清除，在其周圍形成纖維蛋白基質，進而形成纖維包膜包裹生物材料［4］，將其與周圍組織分離，形成僅有機械支撐功能的惰性材料，割斷了骨微環境中骨髓與材料間的相互作用，成骨細胞無法附著材料表面形成新骨，而此時骨缺損部位完全被纖維組織填充，最終導致植入材料無法降解、新骨無法長入替代，骨缺損修復失敗［11］。

近年來隨著骨免疫在骨再生領域的研究不斷深入，研究者逐漸發現在局部骨微環境的形成中，生物材料植入體內后引起局部骨微環境中免疫應答的變化是決定誘導成骨、骨重塑成功與否的核心因素之一［12-13］。良好的免疫應答可通過調節生長因子、趨化因子、炎癥因子等多種因子表達，調控骨再生中成骨分化、破骨分化、纖維化和血管化等多個與骨再生密切相關的過程，在骨再生過程中發揮關鍵作用［14］。因此，本文就主要參與骨移植材料微環境中免疫應答的免疫細胞和細胞因子間的作用機制進行綜述，從而明確骨微環境免疫應答調控缺陷的關鍵難題，進而為開發具有良好骨免疫調節特性的生物材料提供一些啟示與思考。

1 免疫細胞在骨微環境免疫應答中的作用和機制

1.1 中性粒細胞 生物材料植入體內后，臨時基質中的炎癥細胞立即招募中性粒細胞對生物材料進行吞噬降解，中性粒細胞成為最先被激活到達材料周圍血液中的免疫細胞［4］，然后分泌趨化因子單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和巨噬細胞炎性蛋白-1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β），誘導募集單核巨噬細胞到達損傷部位［3，15］。一些學者也認為早期炎癥中性粒細胞的浸潤和分泌趨化因子的行為是骨微環境中控制骨折愈合的關鍵限速步驟［16］。此外，中性粒細胞也可表達NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），并通過RANKL/NF-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）通路調節破骨細胞生成，觸發骨吸收調節［17］。還有研究表明中性粒細胞還可通過在骨折后48 h 內快速合成纖維連接蛋白促進骨折愈合［18］。中性粒細胞的募集與蛋白質和巨噬細胞在生物材料上的募集吸附密切相關，影響材料的生物相容性，因此調控中性粒細胞功能成為生物材料設計的重要關注點。

1.2 單核/巨噬細胞 單核/巨噬細胞是生物材料誘導免疫應答中最重要的效應細胞之一，材料植入體內后立即啟動急性炎癥反應，急性炎癥后單核細胞黏附于損傷部位，并分化為巨噬細胞和多核巨細胞進入慢性炎癥過程，巨噬細胞可隨著骨微環境的變化而改變為不同表型，這種表型變化對骨缺損修復的成敗具有至關重要的作用［19-20］。一般來說，巨噬細胞表型分為M1 型（經典活化）和M2 型（交替活化），M1表型被稱為促炎型，產生一系列促炎細胞因子、趨化因子等，通過誘導骨微環境的炎癥反應保護組織免受外來物質的侵襲，同時上調RANKL 增強破骨細胞分化和骨吸收［21］；而M2 表型被稱為抗炎型，產生抗炎細胞因子，抑制炎癥，并促進血管生成、組織愈合和骨組織的再生［4］。值得注意的是，巨噬細胞表型的變化并不是單純從M1 向M2 的變化，而是在不同的免疫應答過程中形成不同比例的混合表型［22］。目前研究普遍認為理想的生物材料應當充分誘導M1 向M2 轉換，減輕炎癥反應，促進骨組織重建修復［23-24］。但也有文獻報道，過度激活M2型巨噬細胞會增加促纖維化因子（TGF-β1、TGF-β3等）釋放，反而導致生物材料被炎性纖維組織包裹而修復失敗［25-26］。因此只有充分理解巨噬細胞表型在不同免疫應答階段的變化規律，才能更好地調控骨微環境向有利于成骨的方向變化，進而促進骨愈合，修復骨缺損。

1.3 淋巴細胞 淋巴細胞包括T 淋巴細胞和B 淋巴細胞，在骨微環境中承擔不同功能。生物材料植入后，隨著時間的推移，由急性炎癥逐漸轉變為慢性炎癥，慢性炎癥激活的T 細胞可增強骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化，參與慢性炎癥下的骨再生［27］。T 細胞也分為不同亞群，其中Th1和Th2均通過分泌INF-γ和IL-4抑制破骨細胞形成，而Th17 細胞和Th17 相關細胞因子可導致RANKL 水平明顯升高，誘導破骨細胞形成［28］。另一方面，CD4+T 細胞通過IL-4、IL-10 和CTLA-4 抑制破骨細胞分化，NKT 細胞表達巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）和RANKL 誘導破骨細胞形成［29］。B 淋巴細胞是骨髓源性OPG 的主要來源，約占64%［30］。B 淋巴細胞產生的OPG在Th1細胞因子存在的情況下抑制破骨細胞功能，并通過Th2 細胞因子發揮催化作用。B 淋巴細胞與T 淋巴細胞通過CD40/CD40L 共刺激通路協同上調OPG，因此B 淋巴細胞被認為是破骨細胞形成的主要抑制劑之一［31］。總體而言，當前對于淋巴細胞在骨再生中的作用研究尚缺乏，鮮有文獻闡明不同階段T 淋巴細胞和B 淋巴細胞在骨再生中的具體作用，該領域有待進一步探索［16］。

1.4 其他免疫細胞 還有一些免疫細胞也參與了骨微環境中的免疫調控，包括肥大細胞和樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）等。肥大細胞主要參與破骨細胞形成，因此肥大細胞數量的增多會導致骨丟失增加，而肥大細胞數量減少則會影響骨重塑［32-34］。DCs 影響T 淋巴細胞的免疫功能，成熟的DCs 可激活并上調Th17 細胞促進破骨形成［35］。與此同時，DCs 在與CD4+T 細胞的相互作用中，通過MCSF 和RANKL 通路轉分化為破骨細胞［36］。另一方面，DCs可以攝取抗原（例如壞死的組織和細胞、引起蛋白質構象變化的生物材料等），然后將其呈遞給T淋巴細胞，同時釋放細胞因子，改變局部免疫微環境，調控下一步的抗原特異性免疫反應［37-38］。當前對于這些免疫細胞發揮成骨調節作用的詳細過程報道較少，對其在骨免疫應答不同階段所起的調節作用仍有待進一步研究。

2 細胞因子在骨微環境免疫應答中的作用和機制

2.1 促炎細胞因子 生物材料植入體內后誘導的代表性促炎細胞因子包括TNF-α、IL-1α/β和IL-6［39-40］，這些細胞因子主要由促炎M1 巨噬細胞分泌，多種促炎細胞因子間的交叉作用在維持早期骨免疫環境、招募MSCs 至骨缺損部位、刺激MSCs 增殖和分化等方面極為重要［16］。其中TNF-α、IL-1α/β 和IL-6可通過RANKL/RANK/OPG 系統增強破骨細胞分化和吸收活性，抑制成骨細胞活性和骨形成［22，41］。但有研究表明，低劑量的TNF-α（1 ng/ml）可將肌源性基質細胞招募到骨缺損部位，增強其成骨分化，促進骨修復［42］。促炎細胞因子含量在高表達幾天后迅速下降，值得注意的是，TNF-α 和IL-1β 的表達水平呈現雙峰模式，即在炎癥初期前24 h 和骨重塑末期出現高峰［43］。另一些研究則表明在早期炎癥中，低劑量的TNF-α 和IL-6 能促進MSCs 向損傷部位招募，并刺激其向成骨細胞分化，有利于新骨的形成［44-45］。而持續性炎癥時這些促炎細胞因子則會發揮其原本的促破骨抑制成骨作用，對骨再生產生負面影響［46］。SCHMIDT-BLEEK 等［47］對正常和延遲骨愈合模型中細胞因子分泌譜進行的研究表明，延遲骨愈合模型中促炎細胞因子較正常骨愈合模型顯著增加。因此筆者認為在生物材料誘導的骨微環境中，早期促炎因子低劑量釋放有利于MSCs 的招募，促進成骨；而促炎因子高劑量釋放或持續釋放導致的長期炎癥環境則阻礙成骨。提示骨微環境中不同細胞因子、免疫細胞、成骨/破骨細胞、MSCs的相互作用需要動態的視角進行認識與分析。

2.2 抗炎細胞因子 生物材料植入體內后誘導的代表性抗炎細胞因子包括IL-1RA、IL-4、IL-10、TGF-β，除IL-4 外，這些細胞因子主要由抗炎型M2巨噬細胞分泌［4］。IL-1RA 是IL-1（促炎細胞因子）的抑制劑，通過調節IL-1 的成骨不良作用促進骨形成［39］。IL-4也是巨噬細胞M2表型的強誘導因子，可加速成骨細胞增殖，但一定程度上會抑制成骨細胞分化，而IL-10 則可增強成骨細胞分化，并具有抗破骨細胞作用［26，39，48］。CHA 等［49］通過對IL-4 誘導三維水凝膠中M2 巨噬細胞的研究認為，不良免疫反應是導致生物材料植入和臨床轉化失敗的關鍵因素，盡管炎癥是組織再生的重要組成部分，但慢性炎癥的產生最終會導致骨修復失敗。HACHIM 等［50］進行的體外實驗證明IL-4 涂層處理的生物材料促進了M2 表型的極化，體內研究實驗證明，在免疫應答的早期階段，使用IL-4涂層植入物的小鼠在組織-植入物界面的M2 巨噬細胞百分比增加，M1 巨噬細胞百分比減少，促進早期巨噬細胞向M2 轉化，有利于生物材料周圍纖維包裹的減少和后期骨整合能力的改善。TGF-β 是骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路的上游成骨細胞因子，能誘導MSCs 向成骨細胞分化［51］。與此同時，TGF-β還是纖維化過程中的關鍵細胞因子，通過成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor-2，FGF-2）/細胞外調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）途徑誘導成纖維細胞增殖［52］。綜上所述，生物材料介導的骨微環境中的抗炎細胞因子對成骨多發揮有利作用，但TGF-β 的過表達可能導致材料表面纖維化，形成纖維包裹，影響后期的骨整合，因此將TGF-β 作為減少纖維化的靶點細胞因子可能成為未來生物材料設計的關鍵點。

2.3 其他細胞因子 另一些細胞因子也被報道參與生物材料誘導的骨微環境免疫調控，通過調節成骨與破骨平衡、骨重塑等途徑對骨缺損修復產生影響。MSCF 由成骨細胞表達，通過Akt 和MAP 激酶途徑與受體（c-Fms）結合，刺激RANK 表達，誘導破骨前細胞分化，調節破骨細胞的存活和凋亡［53］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是內皮細胞高度特異性的有絲分裂原，與酪氨酸激酶受體結合導致內皮細胞增殖、遷移和新血管生成，是骨再生過程中最重要的血管生成因子之一［54］。研究表明，VEGF 在各種動物模型中通過耦合調節骨生成與血管生成實現骨再生［55-56］。IL-33是破骨細胞的抑制劑，與IL-4 結合后可促進單核細胞向DCs 和巨噬細胞分化，抑制破骨前體細胞和破骨細胞分化，干擾破骨細胞形成［57-58］。其他細胞因子如IL-10、IL-17、IFN 家族等也通過不同途徑在骨再生中發揮重要作用。IL-10 可通過干擾活化T 細胞胞漿核因子表達抑制骨吸收，而核因子是破骨細胞分化的重要因素［59］。IL-17可引起局部炎癥、刺激RANKL 表達，并通過誘導TNF-α和IL-1激活破骨前體細胞［60］。IFN家族主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，均可抑制破骨細胞分化［61］。除上述細胞因子外，IL-11、IL-8、CXCL12、CCL2 也可能參與破骨細胞的形成［57，62-63］。但目前對于這些細胞因子在骨免疫微環境中的相互影響和具體機制報道較少，尚待進一步研究。

3 發展與展望

目前的研究雖然對骨微環境中免疫應答的機制有了一定的了解，但許多問題仍然沒有解決，一些免疫細胞和細胞因子的作用機制尚未闡明，研究者需要進一步探索不同免疫細胞在免疫調控不同階段的動態變化，深入理解各種免疫細胞因子在不同修復時期發揮的作用和相互影響。本團隊認為誘導新骨生成和實現完整功能的新骨填充骨缺損部位的關鍵點應該在合理調節巨噬細胞功能上，包括抑制炎癥性巨噬細胞活性、促進巨噬細胞向M2型極化，其他免疫細胞和細胞因子應動態協同調控該過程，進而改善局部微環境的成骨效應，增強骨整合并促進新骨形成。同時由于免疫細胞具有自分泌、旁分泌特點，應將骨微環境中參與免疫應答的免疫細胞和細胞因子看作一個彼此獨立、相互影響的整體進行評估和分析。當前生物材料正在從傳統誘導免疫耐受的惰性材料向誘導主動免疫應答并具有“免疫調節”能力的生物材料方向發展。闡明生物材料誘導的骨微環境中的免疫應答機制是突破當前材料的“免疫應答調控缺陷”瓶頸的“金鑰匙”，探索材料“適度誘導”免疫調控、“精準調控”目標因子、與不同階段的免疫微環境“交互反饋”及對成骨和破骨細胞實時“動態調控”的改性策略將是未來材料的研究方向。隨著學者們的深入研究與不斷探索，利用具有主動免疫調節特性并且能根據不同階段骨微環境變化而自主響應的“智能化”生物材料，實現新骨的再生和臨界尺寸骨缺損的良好修復終將成為現實。