人參皂苷Rh2 對人肺泡上皮癌細胞A549上皮-間充質轉化的影響及其機制研究

孟禮飛，趙偉軍，李晨蔚，陳磊

上皮-間充質轉化（EMT），即上皮細胞失去其上皮功能和特性，逐漸轉變為間充質樣細胞的過程[1-2]。EMT 是纖維化病理的基本標志，在傷口愈合和炎癥中也被激活，反復應激誘導的EMT失調可能導致器官纖維化，因而有望成為慢性氣道疾病新的臨床治療靶點[3]。近年來，有研究表明中醫藥作為治療靶點可以穩定纖維化相關疾病，而人參作為一種中藥已被證明通過其潛在的適應性特性對各種健康狀況有用。人參皂苷是人參的主要活性成分，其中人參皂苷Rh2 屬于人參皂苷，具有抗癌、抗炎及抗糖尿病等作用[4-6]。由于已經發現轉化生長因子- 1（TGF- 1）誘導EMT，因此本研究觀察人參皂苷Rh2 對TGF-1 誘導的EMT 的保護作用，現報道如下。

1 資料與方法

劑和苯基甲基磺酰氟（PMSF）裂解處理或轉染A549細胞中的總蛋白，并用BCA protein kit 進行濃度測定。20l 裂解物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，與一抗在4 ℃下孵育過夜，與二抗在室溫下進一步培養1 h。使用三緩沖鹽水間（TBST）洗滌三次膜，并通過增強化學發光蛋白質印跡法對底物進行可視化。使用Azure Imager c300 化學發光蛋白質印跡法系統對數據進行分析，并使用ImageJ 計算灰度值。二抗為過氧化物酶（HRP）偶聯山羊抗兔IgG 抗體。

1.1 細胞試劑 A549（人肺泡上皮癌細胞系，購自中國科學院昆明細胞庫）；DMEM培養基、FBS（美國Gbico 公司）；青霉素-鏈霉素（美國Gbico 公司）；I 型膠原V30（美國Gbico 公司）；人參皂苷Rh2 和3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）（購自中國上海同田生物公司）；RIPA 緩沖液、TBST 緩沖液（購自美國Alfa 公司）；蛋白酶抑制劑、苯基甲基磺酰氟PMSF 和二甲基亞砜DMSO（購自中國上海生工生物公司）；TGF- 1（美國Sigma公司）；Western blotting 用一抗：GAPDH 和EMT 相關蛋白（購自英國Abcam公司）；二抗（購自美國Invitrogen,公司）；BCA 試劑（中國碧云天公司）。

1.2 細胞培養和處理 在人肺泡上皮癌細胞系A549 中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基，在Forma?Steri-Cult?CO2培養箱中，37 ℃，5%CO2中維持。人支氣管上皮細胞系BEAS-2B 保存在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中，濕度為5%CO2，溫度為37℃。對于EMT誘導，A549 細胞在60 mm培養板中培養，涂有V30（I 型膠原），在含有1%FBS 的DMEM 中，37 ℃，5%CO2，過夜，然后用5 ng/ml TGF- 1 處理48和96 h。同時，為了確定人參皂苷Rh2 對A549 細胞的影響，先用5 ng/ml TGF- 1 作用48 h，然后用人參皂苷Rh2 以30、60 和90mol/L 作用48 h。兩種處理96 h后，倒置光學顯微鏡在×200 倍放大鏡下觀察A549 細胞的形態。

1.3 細胞活力測定 3（-4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）測定，將2×103個轉染或未轉染的A549 細胞置于96 孔板中，37 ℃，5%CO2培養，然后用TGF- 1 或人參皂苷Rh2 單獨或聯合處理。加入MTT 試劑孵育4 h。去除細胞培養液上清后，加入110l的甲醛溶液試劑二甲基亞砜DMSO，搖板10 min，使甲醛晶體溶解。使用Varioskam?LUX 多模微孔板讀卡器測量并記錄波長為490 nm處的光密度（OD）值。

1.4 免疫印跡 采用RIPA 緩沖液聯合蛋白酶抑制

1.5 統計方法 采用SPSS20.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF- 1 作用后A549 細胞形態學變化及EMT相關因子表達情況 TGF- 1 作用96 h 后A549 細胞呈梭狀，見圖1a；通過western blot 檢測EMT相關因子的表達，見圖1b。TGF- 1 治療后，N-鈣黏蛋白、-SMA、纖維連接蛋白表達升高，E-鈣黏蛋白表達降低（均P ＜0.05），見圖1c；上述結果表明TGF-1 誘導的EMT 構建成功。

圖1 TGF- 1 作用后A549 細胞形態學變化及EMT 相關因子表達情況

2.2 人參皂苷Rh2 對TGF- 1 作用后A549 細胞形態變化和活力的影響 人參皂苷Rh2 處理后使TGF- 1 處理的細胞數量減少，見圖2a；同時，發現TGF- 1 對A549 細胞的活性有增強作用，而人參皂苷Rh2 對A549 細胞的活性有抑制作用（均P ＜0.05），見圖2b。

圖2 人參皂苷Rh2 對TGF- 1 作用后A549 細胞形態變化和活力的影響

2.3 人參皂苷Rh2 改善TGF- 1 對A549 細胞EMT相關因子表達的調控 TGF- 1 誘導A549 細胞的N-鈣黏蛋白、-SMA 和纖維連接蛋白表達升高，E-鈣黏蛋白表達降低。而人參皂苷Rh2（30、60 和90mol/L）處理TGF- 1誘導的A549 細胞48 h后，A549細胞中的E-鈣黏蛋白表達上調，N-鈣黏蛋白、-SMA和纖維連接蛋白表達下調（均P ＜0.05），見圖3。

圖3 人參皂苷Rh2 改善TGF- 1 對A549 細胞EMT 相關因子表達的調控

3 討論

TGF- 1 是肌成纖維細胞分化和促纖維化微環境形成的主要生長因子[4]，已被發現不僅參與COPD和肺纖維化的發病機制，還參與被稱為EMT的生物學過程[5-7]。EMT 的生物學過程，即上皮細胞向運動間充質細胞的轉分化，被認為是發育、傷口愈合和干細胞行為的重要組成部分，在病理上促進了纖維化和癌癥的進展，并受到包括E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、-SMA 和纖維連接蛋白在內的幾個關鍵轉錄因子的調節和介導[8]。本研究不僅在A549 細胞中發現了梭狀形態，而且再次證實了TGF- 1 對A549 細胞中N-鈣黏蛋白、-SMA和纖維連接蛋白表達的促進作用以及對E-鈣黏蛋白表達的抑制作用，表明體外EMT 模型構建成功。

作為最普遍的草本植物，人參已被指出具有多種藥理活性，包括抗氧化應激，抗炎癥，甚至抗癌作用[9-11]。人參皂苷Rh2 是人參皂苷的一個成員，已被發現并證明其在多種疾病中發揮作用[12-13]。本研究在肺泡上皮癌細胞A549 中證實了人參皂苷Rh2 對EMT 相關因子的影響，發現人參皂苷Rh2 對TGF-1 誘導EMT 相關因子的調節發揮了逆轉作用。具體而言，本研究驗證了人參皂苷Rh2 可提高TGF- 1處理細胞中E-鈣黏蛋白的表達，降低N-鈣黏蛋白、-SMA 和纖維連接蛋白的表達，并部分逆轉TGF- 1誘導的肺泡上皮癌細胞A549 的形態學變化，這表明人參皂苷也可能對TGF- 1 誘導的肺泡上皮癌細胞A549 的EMT 具有保護作用。

綜上所述，本研究證明了人參皂苷Rh2 對TGF-1 誘導的肺泡上皮癌細胞A549 EMT 的保護作用。雖然目前的研究并沒有在小鼠體內模型中證實人參皂苷Rh2 對纖維化相關疾病的作用，這是本研究的局限性之一，但本研究有助于為研究和評價人參皂苷Rh2 通過抑制與纖維化相關疾病發生和進展奠定理論基礎。此外，本研究結果可以從另一個角度證明中醫在臨床中預防和治療纖維化相關疾病的應用，并為未來治療纖維化相關疾病提供可能的方法。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 孟禮飛：實驗操作、論文撰寫；趙偉軍：數據整理、統計學分析；李晨蔚、陳磊：研究指導、論文修改、經費支持