高效液相色譜法測(cè)定鐵皮楓斗顆粒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1 含量

陳亞文，張建軍，伍小芳，趙星宇，王聰慧，喬灝祎，谷洪順，王衛(wèi)茜，費(fèi)文婷，李振皓，王林元*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102401；2.北京采瑞醫(yī)藥科技研究院，北京 100094；3.金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，浙江 金華 321299）

鐵皮楓斗顆粒配方由西洋參、鐵皮石斛、靈芝三種原料組成，方中西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津[1]；鐵皮石斛被譽(yù)為滋陰圣品，有補(bǔ)益五臟，清熱，養(yǎng)陰生津之功效；靈芝有補(bǔ)益臟腑之氣、健脾補(bǔ)肺、寧心安神、扶正固本之功。現(xiàn)代研究表明人參皂苷為西洋參的主要活性成分[2-3]，鐵皮石斛、靈芝中的多糖類為主要活性成分[4-5]，對(duì)人體免疫功能、抑菌等都有調(diào)節(jié)作用。三者同用，益氣養(yǎng)陰，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

目前，鐵皮楓斗顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以粗多糖、總皂苷作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究對(duì)其西洋參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1進(jìn)行含量測(cè)定方法的建立及方法學(xué)驗(yàn)證，為產(chǎn)品建立科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，并為闡明其增強(qiáng)免疫力益氣養(yǎng)陰物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，配置紫外檢測(cè)器（Waters，美國(guó)，型號(hào)：e2695）；液相色譜柱（Waters XSelect HSS T3 5 μm）；分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號(hào)：SQP QUINTIX35-1CN]；超聲波水浴清潔器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-100E）

1.2 試劑 人參皂苷Rg1對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：G30N10Y104330）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：A28GB158609）；人參皂苷Re 對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：J25GB15273）；鐵皮楓斗顆粒（批號(hào)：20210501，20211103，20211111）；陰性樣品（不含西洋參，實(shí)驗(yàn)室按處方自制）；鐵皮石斛（批號(hào)：Y21090901），靈芝（批號(hào)：Y21090902），本實(shí)驗(yàn)所用鐵皮楓斗顆粒、鐵皮石斛、靈芝均由金華壽仙谷藥業(yè)有限公司提供；甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?hào)：0212220401）；乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?hào)：0114220309）；娃哈哈純凈水。本方法所有試劑均為分析純或以上規(guī)格。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水為流動(dòng)相B，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；色譜柱為Waters XSelect HSS T3 5 μm；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫為40℃；具體梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re 對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL 各含人參皂苷Rg10.6 mg、人參皂苷Re 1.5 mg、人參皂苷Rb10.3 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取鐵皮楓斗顆粒約3.000 g，精密稱定，加入適量甲醇使其溶解，再轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，靜置1 夜，超聲10 min，離心（3 000 r/min，3 min），取上清液，即得。

2.4 陰性對(duì)照品溶液制備 依照制備工藝和“2.3 項(xiàng)”下供試品溶液的制備方法，制備鐵皮楓斗顆粒（西洋參空白樣），制成陰性對(duì)照品溶液。

2.5 重復(fù)性考察 取同一批次鐵皮楓斗顆粒約3.0 g，平行6 份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rb1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative stangard deviation， RSD）值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 重復(fù)性考察結(jié)果

2.6 精密度考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 人參皂苷 Rg1、Re、Rb1 精密度考察結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度考察 取同一批鐵皮楓斗顆粒約1.5 g，精密稱定，分別按照1:0.5、1:1、1:1.5 的比例加入對(duì)照品溶液，每個(gè)比例進(jìn)行3 次平行操作，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rb1的平均加樣回收率以及回收率RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 準(zhǔn)確度考察結(jié)果

2.8 專屬性考察 制備西洋參空白溶液，檢查西洋參空白對(duì)結(jié)果是否有影響。如圖1 ～圖3 所示，西洋參空白在人參皂苷Rg1、Re、Rb1出峰位置沒(méi)有出現(xiàn)明顯定量峰，對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品人參皂苷Rg1、Re、Rb1的定量不造成影響。

圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 對(duì)照品譜圖

圖2 供試品譜圖

圖3 缺西洋參陰性對(duì)照譜圖

2.9 線性關(guān)系考察 制備5 份不同濃度的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為4.00 mg/mL、2.00 mg/mL、1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、0.25 mg/mL；制備5 份不同濃度的人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為8.00 mg/mL、4.00 mg/mL、2.00 mg/mL、1.00 mg/mL、0.50 mg/mL；制備5 份不同濃度的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1.60 mg/mL、 0.80 mg/mL、0.40 mg/mL、0.20 mg/mL、0.10 mg/mL，以測(cè)得的待測(cè)組分峰面積作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，列出回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2和線性范圍，見(jiàn)表5。

表5 回歸方程結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一鐵皮楓斗顆粒供試品溶液，在樣品配制0、2、6、12、18、24 h 時(shí)分別進(jìn)樣，計(jì)算各時(shí)間色譜峰與0 h 的峰面積的相對(duì)偏差以及各時(shí)間色譜峰RSD，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.11 含量測(cè)定 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備鐵皮楓斗顆粒溶液，并在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下分別測(cè)定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 鐵皮楓斗顆粒中3 種皂苷類成分的含量 mg/g

3 討論

3.1 測(cè)定成分選擇 鐵皮楓斗顆粒由西洋參、鐵皮石斛、靈芝配伍組成，針對(duì)免疫力低下屬氣陰兩虛人群，具有增強(qiáng)免疫力的功能。其技術(shù)要求為功效成分或標(biāo)志性成分含量應(yīng)符合每100 g 含總皂苷3.05 g，粗多糖14.22 g[6]。然而，以上2 種標(biāo)志性成分均采用紫外吸收光譜法進(jìn)行檢測(cè)，專屬性較差。因此，本研究構(gòu)建了一種以單一成分（人參皂苷Rg1、Re、Rb1）作為鐵皮楓斗顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用高效液相色譜法檢測(cè)物質(zhì)含量，建立更加精確、專屬、可控的檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。

配方中西洋參為君藥。西洋參味甘、微苦，涼，歸心、肺、腎經(jīng)，可補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津；適用于氣虛陰虧，虛熱煩倦，咳喘痰血，內(nèi)熱消渴，口燥咽干。西洋參皂苷可以顯著減輕缺氧-再灌注誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞活力抑制、早期凋亡加速和能量代謝紊亂，調(diào)節(jié)激活腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα），葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4），磷酸果糖激酶2（PFK2）蛋白質(zhì)表達(dá)水平，西洋參皂苷在保護(hù)心室肌細(xì)胞免受缺氧-再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和能量代謝紊亂方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[7]。低極性人參皂苷通過(guò)減輕肝損傷，提高抗炎能力與機(jī)體免疫力，對(duì)李斯特菌感染的小鼠有較好的保護(hù)作用[8]。斑馬魚(yú)尾部中性粒細(xì)胞數(shù)目會(huì)因西洋參皂苷類成分的存在而大幅度提升，表明西洋參皂苷類成分提高免疫功能作用顯著[9]。人參皂苷Rg1作為一種免疫增強(qiáng)劑，可增加地塞米松造模的免疫力低下小鼠的脾臟指數(shù)，增加sIgA 的生成，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)來(lái)增強(qiáng)免疫力[10]。人參皂苷Re 可以抑制6-羥基多巴胺觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)活性氧類的積累和膜類脂的過(guò)氧化作用來(lái)減少細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激[11]。人參皂苷Rb1通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠肺中的核因子E2 相關(guān)因子（Nrf2）信號(hào)通路增強(qiáng)了氧化防御系統(tǒng)，增加線粒體凋亡相關(guān)基因來(lái)減輕金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡[12]。《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版中西洋參以人參皂苷Rg1、Re、Rb1作為標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定。鐵皮石斛以多糖類、甘露糖進(jìn)行定量，靈芝以多糖、三萜及甾醇類物質(zhì)進(jìn)行定量，方法專屬性較差，沒(méi)有特異性成分含量測(cè)定的敘述。本研究現(xiàn)對(duì)君藥西洋參中3 種人參皂苷類單體成分進(jìn)行含量測(cè)定，可用于鐵皮楓斗顆粒中皂苷類成分的快速檢測(cè)，對(duì)鐵皮石斛、靈芝中的標(biāo)志性成分的檢測(cè)將放入后續(xù)研究中。現(xiàn)以西洋參人參皂苷Rg1、Re、Rb1為含量測(cè)定標(biāo)志物，方法準(zhǔn)確可靠且專屬性強(qiáng)。依據(jù)中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分評(píng)價(jià)體系的原則[13]，可以增加人參皂苷Rg1、Re、Rb1作為標(biāo)志性成分進(jìn)行鐵皮楓斗顆粒的質(zhì)量控制。

3.2 色譜條件的選擇 本研究在《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版一部“西洋參”項(xiàng)下的基礎(chǔ)上，參照色譜峰分離效果、保留時(shí)間等指標(biāo)，結(jié)合鐵皮楓斗顆粒的配方特點(diǎn)，對(duì)其方法進(jìn)行優(yōu)化。首先對(duì)色譜柱Waters Sunfire C185 μm 和Waters XSelect HSS T3 5 μm 進(jìn)行考察，按照藥典方法進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，在Waters Sunfire C185 μm 色譜柱的檢測(cè)中，人參皂苷Rg1、Re、Rb1色譜峰分離度均較差；Waters XSelect HSS T3 5 μm 色譜柱的檢測(cè)結(jié)果中，人參皂苷Rg1、Re色譜峰分離度達(dá)到了1.47，人參皂苷Rb1峰形也有所改善，說(shuō)明此產(chǎn)品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1更適合使用三鍵鍵合的硅膠柱進(jìn)行檢測(cè)，使之提高分離度，改善峰形。鐵皮楓斗顆粒由西洋參、鐵皮石斛、靈芝配伍而成，成分復(fù)雜，相互干擾。在25 min 后通過(guò)逐步調(diào)整乙腈比例，使人參皂苷Rg1、Re 色譜峰分離度＞1.5；并在后續(xù)方法中加入等度洗脫等方法，大幅縮短了出峰時(shí)間；調(diào)整人參皂苷Rb1出峰時(shí)間及流動(dòng)相比例，提高其分離度，減少其他物質(zhì)干擾，最終確定最佳梯度洗脫條件為表1。該法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可更好地用于鐵皮楓斗顆粒的質(zhì)量控制。

本研究通過(guò)色譜柱的篩選，對(duì)流動(dòng)相洗脫方法進(jìn)行了優(yōu)化，以在鐵皮楓斗顆粒原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量測(cè)定。本研究解決了復(fù)方產(chǎn)品中色譜峰干擾的問(wèn)題，并進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗(yàn)證。對(duì)3 批樣品進(jìn)行測(cè)定，人參皂苷Rg1、Re、Rb1的 總 含 量 分 別 為17.85 mg/g、17.36 mg/g、17.63 mg/g。此定量分析方法穩(wěn)定準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便可行，可用于鐵皮楓斗顆粒中皂苷成分的快速檢測(cè)，為更好地控制鐵皮楓斗顆粒產(chǎn)品質(zhì)量以及探究功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。