高效液相色譜-電霧式檢測器法測定益母草中鹽酸水蘇堿

盧柏林，馬恩耀,2，周勁松,2，孫心恒，謝珊珊

（1.廣東漢潮中藥科技有限公司，廣東 廣州 510360；2.廣州采芝林藥業有限公司，廣東 廣州 510360）

益母草屬于唇形科植物，具有活血消腫、調經利尿、清熱解毒等多種功效，常作為治療月經不調、痛經經閉、惡露不盡、水腫尿少和瘡瘍腫毒等癥狀的主治藥物[1]。益母草中的主要化學成分包括生物堿類、環烯醚萜類、二萜類、苯丙醇苷類、黃酮類和香豆素類等，同時含有鐵、錳、鋅、鉛等多種微量元素。生物堿類中的益母草堿及鹽酸水蘇堿屬于益母草的重要活性成分[2-3]，因此是益母草質量控制重點關注的成分。

在2020 年版《中國藥典》中，首次在通則0512“高效液相色譜法”的高效液相色譜儀檢測器中補充了電霧式檢測器（Charged Aerosol Detector，CAD）。CAD 是基于霧化-氣溶膠的檢測器，其檢測原理是將液相洗脫液霧化蒸發后檢測溶質顆粒的帶電粒子的信號流，具有靈敏度高、重復性好、不依賴于化學結構信號響應一致性、動態檢測范圍寬、操作直觀簡單的優點，適用于分析各種不揮發或半揮發性化合物[4]。中藥中含有大量糖類及苷類等紫外吸收弱的成分，因此電霧式檢測器在中藥分析研究中應用越來越廣泛[5-8]。

蒸發光散射檢測器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）屬于通用型檢測器，是擴充高效液相色譜檢測范圍的重要檢測器之一。因此，對于類似益母草中鹽酸水蘇堿等無紫外吸收成分的含量測定，現多采用高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）搭配ELSD 檢測器的方法進行檢測。但ELSD 檢測器本身存在線性范圍較窄、基線噪音偏大、影響因素較多等缺點。在《中國藥典》益母草項下鹽酸水蘇堿的測定方法中，供試品中鹽酸水蘇堿目標峰前容易有干擾峰，分離度較差，需要在要求范圍內更改流動相比例或柱溫、流速等才能把目標峰與干擾峰分離，從而達到準確定量的效果，但相對會影響效率。因此，本次試驗將用CAD 檢測器代替ELSD 檢測器對益母草中鹽酸水蘇堿進行測定，以準確定量和提高效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益母草，購于市場。

鹽酸水蘇堿對照品（批號：110712-201916），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），CNW；冰醋酸（AR）、乙醇（AR），天津市大茂化學試劑廠；水為超純水。

1.2 儀器與設備

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀（配備Corona Veo RS CAD 檢測器），Chromeleon 7.0 色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；水浴鍋，常州國宇。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-Diol（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶0.2%冰醋酸=80 ∶20；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。CAD 檢測器條件：霧化溫度為40 ℃，數據采集頻率為20 Hz，過濾常數為1.0 s。

1.3.2 對照溶液的制備

取鹽酸水蘇堿對照品適量，在精密稱定后加入70%乙醇溶液配制成濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

將益母草磨成粉過三號篩，稱取粉末約1.0 g，在精密稱定后置于具塞錐形瓶中，在精密加入25 mL 的70%乙醇溶液后，稱定重量，水浴加熱回流2 h，放冷后再稱定重量，用70%乙醇溶液補足減失的重量，搖勻后過濾，棄去初濾液，取續濾液，即得。

1.3.4 樣品的測定

取不同產地批次的益母草，按1.3.3 項下方法操作，按1.3.1色譜條件測定，同時也按照2020年版《中國藥典》一部中益母草項下的鹽酸水蘇堿測定方法進行測定，并計算鹽酸水蘇堿的含量，將兩者結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化結果

2.1.1 檢測器的選擇

在《中國藥典》及多個地方標準當中，益母草中鹽酸水蘇堿的測定方法多選擇高效液相色譜儀搭配蒸發光散射檢測器。由于蒸發光散射檢測器本身的特殊性，往往在實際操作當中需要提前開啟蒸發光穩定較長的時間，而且基線噪音的影響比較明顯。因此，本實驗選擇同為通用檢測器的電霧式檢測器代替蒸發光散射檢測器對鹽酸水蘇堿進行檢測，測定結果與HPLC-ELSD 法基本一致。

2.1.2 流動相的選擇

在《中國藥典》中，益母草中鹽酸水蘇堿的測定方法為HPLC-ELSD，流動相為乙腈-0.2%冰醋酸；當把相同的流動相用于HPLC-CAD 時發現，能把供試品中的干擾峰分離，但分離度只能達到1.04 左右。本實驗將流動相改為甲醇-0.2%冰醋酸，供試品中的干擾峰會被提前洗脫，鹽酸水蘇堿目標峰前后均沒有影響結果的干擾峰，并且檢測結果與HPLC-ELSD 基本一致[9-10]。這說明，以甲醇-0.2%冰醋酸為流動相，利用電霧式檢測器檢測鹽酸水蘇堿效果較好。

2.2 色譜圖

按優化后的1.3.1 色譜條件測定對照品溶液和供試品溶液，可看出供試品中其他成分對鹽酸水蘇堿目標峰無干擾。鹽酸水蘇堿對照品溶液、益母草供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 益母草HPLC-CAD 色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性和范圍

將1.3.2 對照溶液（實際濃度為0.501 mg·mL-1）依次進樣1 μL、2 μL、3 μL、6 μL、8 μL 和10 μL 測定各成分的峰面積，以進樣量（μg）的對數值為橫坐標（x），以峰面積的對數值為縱坐標（y），進行線性回歸。結果表明，鹽酸水蘇堿在0.50～5.01 μg 線性良好，回歸方程為y=5.631 2x-0.276 2，r=0.999 5。

2.3.2 精密度

精密吸取對照品溶液，進樣6 μL，按1.3.1 色譜條件測定，連續進樣6 次，結果見表1。鹽酸水蘇堿峰面積的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.33%，表明儀器精密度滿足要求。

表1 鹽酸水蘇堿精密度測定結果表

2.3.3 重復性

精密稱取同一批益母草粉末（過三號篩）6 份（每份約1 g），按1.3.3 項下方法操作，制成供試品溶液，按1.3.1 色譜條件測定，結果見表2。樣品鹽酸水蘇堿含量的RSD 是0.69%，表明本法重復性良好。

表2 鹽酸水蘇堿重復性測定結果表

2.3.4 準確性

精密稱取已知含量的同一批益母草粉末（過三號篩）6 份（每份約1 g），每份加入鹽酸水蘇堿4.008 mg，按1.3.3 項下方法操作，按1.3.1 色譜條件測定，計算回收率，結果見表3。鹽酸水蘇堿的平均回收率是100.28%，RSD 為1.43%，表明本法準確性良好。

表3 鹽酸水蘇堿準確性測定結果表

2.3.5 穩定性

對同一供試品溶液，分別于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h 和24 h 的6 個時間點，按1.3.1 色譜條件測定，測定結果見表4。鹽酸水蘇堿峰面積的RSD 為0.58%，可表明益母草供試品溶液中鹽酸水蘇堿成分能在24 h內保持穩定。

表4 穩定性測定結果表

2.4 樣品的測定

對6 批次益母草樣品中鹽酸水蘇堿含量進行測定，結果見表5。結果顯示，各批益母草的CAD 法結果與ESLD 法結果的相對平均偏差為0%～1.08%，表明采用CAD 法結果與ESLD 法結果基本一致。另對6 批次的CAD 法與ELSD 法2 組結果使用SPSS 22 進行獨立樣本t檢驗，結果顯示Levene 統計量為1.509，顯著性P值為0.247 ＞0.05，故方差齊性；兩組間獨立樣本t檢驗統計量t=-0.276，P值為0.065 ＞0.01，表明CAD 法結果與ESLD 法結果不存在差異。

表5 含量測定結果表

3 結論

近年來，電霧式檢測器作為一種新型通用型檢測器在中藥分析領域表現出了廣泛的適用性，尤其適用于皂苷、糖類和生物堿類等無紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析與檢測[11]。雖然電霧式檢測器與紫外檢測器、蒸發光檢測器等檢測器相比具有較大的優勢，但其缺點也同樣明顯，如待測物需先經干燥，故難以檢測揮發性物質；該監測器基于氣溶膠方法獲得的濃度和峰面積均為非線性關系，在實際計算中不如紫外檢測器簡單方便，在識別某個峰或進行峰純度分析時也不能像質譜探測器能深度探索[12]。但在實際使用當中可以看出，電霧式檢測器已逐漸成為目前檢測器分析中的重要補充，對提高準確度、擴大檢測范圍起到重要的作用。本文采用高效液相色譜儀搭配電霧式檢測器法檢測益母草中鹽酸水蘇堿含量，具有方法重復性良好、準確度較高、靈敏度較高、操作簡單便捷等優點，可用于對益母草的質量控制。接下來，可繼續探究本方法對于其他物質的適用性，并因為通用性檢測器的特性，可以將其延伸至對多種類型的化合物進行同時檢測。