葉面噴施酵母提取物對赤霞珠葡萄酒香氣物質的影響

成池芳，陳新軍，張如意，劉宗昭

（新疆中信國安葡萄酒業有限公司，新疆釀酒葡萄與葡萄酒重點實驗室，新疆葡萄酒產業創新研究院，新疆 瑪納斯 832200）

香氣是葡萄酒重要的品質指標之一，對葡萄酒的風格和典型性起到至關重要的作用，在很大程度上決定著葡萄酒產品的市場接受度。隨著氣相色譜（Gas Chromatography，GC）和氣質聯用技術（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）的發展與應用，目前在葡萄酒中已鑒定出數百種揮發性香氣物質，包括高級醇類、酯類、脂肪酸類、吡嗪類、萜烯類、降異戊二烯類、揮發性酚類、內酯類和硫化物等，這些化合物之間通過相互作用影響葡萄酒的風味和香氣[1]。釀酒葡萄原料的品質在很大程度上決定了其所釀葡萄酒的風味和品質，通常將這種由釀酒葡萄果實原料帶來的香氣稱為“品種香”。發酵類香氣物質來源于酒精發酵和蘋果酸乳酸發酵階段，主要包括高級醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯和脂肪酸類等。通過栽培措施影響葡萄果實的代謝進而影響所釀葡萄酒的感官是目前研究的熱點。

誘導子是誘導植物生理變化的物質。生物型誘導子來源于生物中，依據其成分可以分為多糖類（如酵母提取物[2]、殼聚糖、甲殼素和葡聚糖[3]等）、低聚糖類（如半乳糖、甘露聚糖等[2]）、蛋白質類（如纖維素酶、糖蛋白、乳鐵蛋白等[2]）。酵母提取物作為一種新型的生物型誘導子已經被國外廣泛使用，用于噴施在葡萄葉面上來提高葡萄果實及葡萄酒品質。目前關于酵母提取物在葡萄中的應用很多，但是相關報道卻較少，大部分研究集中在初級代謝產物以及類黃酮物質上。例如，VILLANGó 等[4]在西拉葡萄葉片上噴施酵母提取物，結果顯示葡萄果實的果皮變厚，果實中可溶性固形物的含量升高，可滴定酸的含量降低，酒中花色苷的含量也明顯升高。國內相關研究則顯示噴施處理能夠提高美樂葡萄果實中類黃酮類物質和還原谷胱甘肽的含量[5]。

本研究通過對赤霞珠葡萄葉面噴施酵母提取物，測定果實采收后所釀葡萄酒中的香氣物質，擬為此栽培措施的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為2013 年定植的赤霞珠葡萄。實驗地位于新疆中信國安葡萄酒業有限公司自建基地（44°14′N，86°15′E），植株株行距為1 m×3 m。采用VSP 葉幕整形，主干高度約65 cm，自根苗。

2020 年選取試驗田中40 行長勢良好，且較為一致的葡萄植株作為試驗對象。每20 行為一個實驗小區，每個小區包含兩種實驗處理，即對照組和實驗組。實驗組噴施酵母提取物，用量為廠家推薦用量（1 kg 干粉/hm2），使用0.1%（體積分數）吐溫80 水溶液作為葉片表面活性劑；對照組只噴施0.1%（體積分數）吐溫80 水溶液。分別于果實轉色5%、轉色完成進行噴施，噴施部位為葉面背面，噴施均勻直至有液滴自然滴落。

1.2 試劑與儀器

酵母D254，法國拉曼公司；乳酸菌，法國拉曼公司。氯化鈉，分析純，天津永大化學試劑有限公司；香氣物質標準品、4-甲基-2-戊醇（內標物質），Sigma-Aldrich。7890GC-5975B MS 氣相色譜-質譜聯用儀，Agilent Technologies；CTC CombiPAL autosampler 多功能自動進樣器；SPME 萃取頭（DVB/CAR/PDMS）；色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大生產發酵

商業采收期對葡萄果穗進行手工采收并運送至酒廠。采用除梗破碎機除梗后加入60 mg·L-1SO2，原料入罐后加入0.2 g·L-1商業酵母以啟動酒精發酵，發酵溫度為24～26 ℃。酒精發酵結束后，人工接種乳酸菌 啟動蘋果酸乳酸發酵，發酵溫度為18～20 ℃。

1.3.2 葡萄酒香氣物質檢測

利用農業農村部葡萄酒加工重點實驗室已優化的頂空固相微萃取方法對葡萄汁和葡萄酒香氣物質進行萃取，并利用氣質聯用法分析樣品中的香氣物質[6]。

（1）頂空固相微萃取（Head Space-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）。20 mL 玻璃樣品瓶中加入5 mL 葡萄酒樣品、1 g NaCl 和10 μL 內標（4-甲基2-戊醇，1.008 6 g·L-1），然后迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊。樣品瓶在40 ℃加熱槽中振蕩30 min（500 r·min-1），然后將已活化的SPME 萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，40 ℃繼續振蕩30 min，取出SPME 萃取頭，立即插入氣相色譜進樣口，進樣口溫度為250 ℃，熱解析8 min。每個樣品重復萃取3 次。

（2）氣相色譜質譜聯用分析條件。色譜柱：HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載 氣為高純氦氣（＞99.999%），流速為1.0 mL·min-1；采用5 ∶1 分流進樣，進樣口溫度為250 ℃；柱溫箱升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持1 min，然后以3 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持5 min。質譜采用電子轟擊離子源，電離能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，輔助加熱器溫度為250 ℃，質量掃描范圍為30～350 unit。

1.3.3 數據處理

采用SPSS 22.0 進行統計分析。

2 結果與分析

本研究中，通過氣相色譜質譜聯用技術共檢測到63 種香氣物質，包括3 種C6 醇類物質、9 種芳香族類物質、17 種高級醇類物質、2 種降異戊二烯類物質、3 種萜烯類物質、2 種醛/酮類物質、6 種脂肪酸類物質、20 種酯類物質和1 種其他類物質。

2.1 C6 醇類物質

與對照組相比，葉面噴施處理顯著提高了葡萄酒中的1-己醇和(E)-3-己烯-1-醇兩種C6 醇類物質的濃度（表1）。一般來說，植物中來自脂氧合途徑的揮發性化合物主要有C6 和C9 的醛、醇和酯，這些物質來自亞油酸和亞麻酸的降解。六碳直鏈脂肪族類化合物因具有典型的綠葉香氣而被統稱為“綠葉氣味化合物”[7]。對于紅葡萄酒來說，C6 醇類物質會給葡萄酒帶來生青味，從而給人留下不成熟的感官印象。在本研究中，葉面噴施組對于C6 醇類物質的提升會加重葡萄酒的生青味，因此對葡萄酒有不利的影響。

表1 噴施酵母提取物對葡萄酒香氣物質的影響表 單位：μg·L-1

2.2 芳香族類物質

芳香族類物質對葡萄酒的香氣也具有一定影響。本研究中檢測到的9 種芳香族類物質中，對照組和噴施組之間沒有顯著差異（表1）。

2.3 高級醇類物質

高級醇又稱雜醇，一般指具有兩個以上的碳原子的一元醇，是酵母代謝中的重要副產物[8]。葡萄酒中低濃度的高級醇會增加葡萄酒的香氣復雜性；高濃度雜醇會給葡萄酒帶來異味，容易引起飲酒后“上頭”，甚至給身體健康造成傷害。在檢測到的17 中高級醇類物質中，僅有2-甲基-1-丁醇受到噴施處理的顯著影響（表1），且在噴施處理葡萄酒中具有較低的濃度。

2.4 萜烯和降異戊二烯類物質

萜烯和降異戊二烯是葡萄果實中的香氣物質，二者在釀酒葡萄中的含量相對較低，均來源于異戊二烯代謝，閾值較低，主要呈現花果香氣，且多以糖苷結合態的形式存在。其糖苷結合態可經過酶解或酸解，形成游離態香氣，對葡萄果實及葡萄酒的香氣有著極其重要的作用。在麝香型的葡萄品種中，萜烯類化合物是品種香的主要貢獻者，而在非芳香型的葡萄果實中，萜烯類化合物的含量通常較低，而降異戊二烯的含量總是遠高于閾值，主要為β-大馬士酮，為‘赤霞珠’等非芳香型葡萄品種的葡萄酒提供了怡人的“玫瑰花”香。在本研究中，噴施組處理顯著提高了葡萄酒中的香葉基丙酮和香茅醇的濃度，其中香葉基丙酮的含量提升了41%，香茅醇的含量提升了30%（表1）。這表明噴施組對葡萄酒中的花香和果香具有促進作用。

2.5 脂肪酸類物質

脂肪酸作為一類重要的植物主代謝產物，在植物的生長發育中起主要作用，其合成是植物適應外界環境條件的結果。一些直鏈脂肪族飽和或不飽和的脂肪醇、脂肪酮、脂肪酸酯類物質均來自果實中脂肪酸的降解，這類香氣物質通過影響葡萄果實香氣對葡萄酒的香氣產生影響。發酵香氣主要來源于糖代謝和氨基酸代謝途徑，屬于酵母等微生物代謝組產生的副產物，包括乙醇、高級醇、脂肪酸等，這類香氣成分在總香味物質中一般占有較高的比例。在測定的6 種脂肪酸物質中，噴施組顯著提高了葡萄酒中辛酸和癸酸的含量（表1）。

2.6 酯類物質

除以上香氣物質，酯類物質受噴施處理的影響也較大。本文測定出的20 種酯類物質中，8 種物質均受到噴施的顯著影響（表1）。噴施處理后，丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、己酸異戊酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯和9-癸烯酸乙酯的濃度均顯著提升。表明葉面噴施酵母提取物處理能夠提升葡萄酒中的果香，這與之前分析的萜烯和降異戊二烯兩類物質的結果一致。

3 結論

本研究探究了噴施酵母提取物對赤霞珠葡萄酒中香氣物質的影響，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法測定葡萄酒中香氣物質，共檢測出63 種香氣物質。從結果來看，葉面噴施酵母提取物提高了葡萄酒中的萜烯、降異戊二烯和酯類物質的濃度，對葡萄酒中的花香和果香有顯著的提升作用。但噴施酵母提取物同時也提高了葡萄酒中C6 醇類物質的濃度，增加了葡萄酒的生青味，有一定的負面影響。