碳納米管摻雜高聚物制備人工神經導管的研究進展

宋功吉, 王煜煜, 王善龍, 王建南,2, 許建梅,2

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院, 江蘇 蘇州 215021; 2. 蘇州大學 紡織行業醫療健康用蠶絲制品重點實驗室, 江蘇 蘇州 215127)

由意外和創傷造成的周圍神經損傷會導致中樞神經與周圍器官之間的感知神經和運動神經異常,甚至會導致自主神經功能的部分或全部喪失,這將會對患者的日常生活造成極大不便[1]。雖然目前可通過自體神經移植手術進行治療,但這種方法的成功率較低,且存在供體神經源有限、供區神經與受損神經匹配度差、手術時間長和需要多次手術等缺陷[2],因此,急需研發新的神經替代物來提高周圍神經損傷修復的效果。人工神經導管可作為一種替代自體神經移植的理想方案,其管狀結構能夠連接被切斷的神經,并作為引導軸突生長的通道,進而促進受損神經的再生[3]。目前,采用編織法、靜電紡絲等紡織加工方法制備的神經導管,融合了紡織、醫學、生物等多學科技術[4],在導管力學性能以及高聚物材料使用方面都具有明顯的優勢。

高聚物因其優異的可加工性、生物相容性和降解性,被廣泛應用于神經組織工程,常用的高聚物包括:絲素蛋白、膠原蛋白、殼聚糖等天然高聚物;聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)和聚己內酯(PCL)等合成高聚物。研究表明,電刺激既能促進軸突的再生,也能為自然細胞的分化提供信號[5],但高聚物通常都是非導電材料,無法產生電刺激響應,因此,可通過表面涂覆或在高聚物中加入導電性物質如碳納米管(CNT)、聚吡咯(PPy)、聚苯胺(PANI)等制備導電性人工神經導管。其中,CNT因其獨特的化學、力學、結構、導電特性以及可改性,在神經組織的修復與再生中備受關注;并且CNT特有的納米形貌更有利于神經細胞的黏附,刺激細胞進行相關基因、生物信號的表達,從而促進細胞增殖與軸突再生;CNT具有一定的細胞毒性與基因毒性,經過功能化處理后,CNT的細胞毒性可明顯降低,因而需要不斷探索復合工藝使CNT與高聚物基體材料結合的穩定性提高,降低其與細胞接觸時的毒性[6]。

本文探討了碳納米管的性能,包括微觀形貌、電學性能和生物相容性等,以及其對神經再生的影響與作用機制;分析碳納米管的功能化改性及其對神經再生的促進機制;高聚物和碳納米管復合制備導電性人工神經導管的方法,以及高聚物與碳納米管復合導電性人工神經導管的再生效果,為導電性人工神經導管的研究和發展提供參考。

1 碳納米管的性能與神經再生

神經再生是指退化了的神經和神經組織的再生、恢復或修復,其與軸突、神經元和突觸等的重新產生有關[7]。神經損傷后,植入人工神經導管為神經組織的再生提供了物理引導[8],而具有導電性的導管更有利于神經再生。碳納米管是具有無縫中空圓柱結構的一維納米級材料,其性能優異,具有尺寸小、比表面積大、長徑比大等特點,還具備非常高的強度和韌性,以及優異的導電性能[9]。高聚物與碳納米管的復合不僅使神經導管具備導電性,且碳納米管的納米形貌和功能化改性,使其在神經修復中發揮著非常好的作用。

1.1 碳納米管的納米形貌

碳納米管的形態結構與神經突起很相似,小的碳納米管束的尺寸也與樹突相似,且碳納米管具有巨大的電化學接觸表面積,可使其與細胞或組織之間的相互作用界面達到最大[10]。高聚物基底上的碳納米管加強了界面處的神經信號傳遞[11],為神經元的存活、分化、生長提供了一個有利的環境[12]。

納米材料的納米形貌表面能構建出類似于細胞外基質的微環境,并能在納米尺度上與神經元膜相互作用[13]。碳納米管界面能為神經元的黏附提供一種納米級的結構引導[6],神經膠質細胞附著在碳納米管上時,也可分泌出一些促進神經元與碳納米管黏附的蛋白質(如纖連蛋白),且當碳納米管的表面粗糙度與神經元突起的長度尺度相適應時,更有利于細胞的黏附[14]。

1.2 碳納米管的電學特性

高聚物摻雜碳納米管改善了神經導管的電傳導性能。純化的碳納米管是神經元良好的生長界面,碳納米管與神經元之間的電耦合也能促進神經信號傳輸效率的增加[15],這是因為碳納米管作為一維導電材料,其各向異性的導電性與神經元的導電性有一定的相似之處,有利于中樞(大腦、脊髓)或周圍神經系統中神經網絡信號的傳導[10]。利用碳納米管的導電特性,配合外部電刺激作用,可更好地促進神經功能的恢復[16]。研究發現:用20 Hz的電刺激1 h,可上調生長因子的表達,能夠增強和加速神經損傷后的功能恢復[17]。因為神經細胞具有內在的電活性,所以高聚物復合碳納米管制備的導電神經支架為其提供了施加電刺激的媒介,進而能夠促進神經突起的生長和活體功能的恢復[16]。

Malarkey等[18]還發現,只有在一定電導率范圍內的碳納米管才能促進神經突的生長,其制備了碳納米管和聚乙二醇接枝共聚物,然后噴涂到熱玻璃片上以形成均勻的導電薄膜,通過調整薄膜厚度分別制備了電導率為0.3、28、42 S/cm的導電膜。在其上進行神經元細胞體外培養發現,電導率為0.3 S/cm時,神經元的分枝與軸突生長的長度均為最優,而更高的電導率水平反而可能會損害細胞的活力。

1.3 碳納米管的生物相容性

生物相容性是指生物材料在宿主的特定環境和部位,與宿主直接或間接接觸時所產生相互反應的能力,是材料在生物體內處于動態變化過程中,能耐受宿主各系統作用而保持相對穩定、不被排斥和破壞的生物學特性。

碳納米管通常與神經元組織表現出較好的相容性。Mattson等[19]在關于碳納米管生物相容性體外研究的首次報道中指出:當神經元在碳納米管上培養8 d后,仍舊存活并繼續生長,表明碳納米管能支持細胞的長期存活,并允許軸突的生長。當通過共價或非共價的方法將CNT牢固固定在高聚物表面上時,CNT不會在體內四處游離而集聚在組織中導致炎癥等不良反應[7]。此外,通過在碳納米管基體材料上形成納米圖案化表面,還可以提高細胞的黏附增殖,引導軸突的生長方向[20]。

經過純化或功能化等方法處理的碳納米管的溶解性提高,且不易集聚,不會對細胞膜造成嚴重的損傷,不會破壞細胞的完整性[21]。Zhao等[22]發現多壁碳納米管氮功能化后具有較低的溶血率,能夠抑制血小板的黏附和血栓的形成,且細胞黏附強度和細胞存活率較高。多項研究[23-24]表明,經過表面功能化改性,碳納米管可獲得較低的毒性和非免疫原性,但碳納米管的加入也一定程度上減緩了高聚物在體內的降解速度[25]。

2 碳納米管的表面改性

碳納米管在生物體內應用時,面臨的最大問題是其潛在的生物毒性與基因毒性。CNT與生物體作用時,通過胞吞進入細胞體內而可能產生潛在的生物毒性,提高細胞內化作用可以顯著降低生物毒性。而CNT的長徑比、聚集度、表面化學基團都是細胞內化作用的重要影響因素。未經處理的CNT不具有水溶性、易團聚,即使劑量很低,也可因為團聚而不是在納米尺度上與細胞作用,從而降低細胞內化作用,影響高聚物/CNT復合導管在細胞體內的降解、代謝等[26],因此,需對CNT進行表面功能化處理來改善其水溶性[27],處理過程見圖1。

圖1 碳納米管的表面功能化

CNT的表面功能化改性有多種方法,最簡單的方法是用帶正電荷或負電荷的化學物質通過共價結合的方法修飾碳納米管,如引入帶正電荷的氨基或帶負電荷的羧基和巰基等[26]。Hu等[28]用帶負電荷的羧基、中性的聚間氨基苯磺酸和帶正電荷的乙二胺,對多壁碳納米管進行功能化改性,結果發現帶正電荷的碳納米管底物上生長的神經元軸突的平均長度明顯更高,這也證明了可以通過化學修飾碳納米管的方法控制神經突的延伸和分支。

碳納米管的表面功能化改性也可通過非共價結合的方式,使用聚合物、表面活性劑包裹碳納米管,改變其表面疏水性,改善其生物相容性,增強與細胞的相互作用。常用的聚合物主要為親水性的聚乙二醇(PEG)、聚乙二胺(PEI)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)等。Heister等[29]將碳納米管聚乙二醇化后進行細胞實驗發現,細胞的存活率顯著提高,聚乙二醇化一方面增強了碳納米管分散穩定性,另一方面也減少了細胞非特異性攝取的能力。動物實驗中,有研究[30]直接將聚乙二醇化的水溶性碳納米管注射到大鼠體內脊髓損傷處,幾周后觀察到損傷部位的神經絲和皮質脊髓束纖維增加。

除以上簡單的表面功能化改性外,還可進行生物功能化改性。一些生物因子[31]如藥物、生長因子、黏附蛋白、基因等,均能夠用來特異性修飾碳納米管,這不僅能降低其細胞毒性,更能促進細胞黏附、軸突生長、神經元分化以及神經組織的再生。

3 高聚物/CNT復合神經導管的制備

復合CNT的導電性人工神經導管主要是通過將碳納米管與高聚物共混或交聯等,再利用3D打印[32]、靜電紡絲[33]和溶液澆鑄[34]等技術進行制備。圖2示出導電性神經導管支架制備方法。表1列出不同高聚物和碳納米管復合制備的導電性神經導管的性能以及體內外應用效果。

注:BAPO—苯基雙 (2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦;PGF—磷酸鹽玻璃微纖維。

3.1 3D打印技術

使用3D打印技術制備導電性人工神經導管,通常將碳納米管和高聚物溶解共混,調配出可以用于打印的生物油墨,然后利用CAD等輔助軟件進行結構設計。Lee等[35]通過3D打印技術成功制備出一種復合神經支架(制備過程見圖2(a)),其將功能化的多壁碳納米管(MWCNTs)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)共混攪拌制備成生物墨水,然后打印出分散性良好且具有可調多孔結構的神經支架。細胞實驗發現該導電性支架能夠有效地促進神經突起的生長。

3.2 靜電紡絲

使用靜電紡絲技術制備導電性人工神經導管,通常在配制紡絲液時,將碳納米管均勻分散到高聚物中進行紡絲。Yu等[25]先將膠原蛋白和聚己內酯(PCL)按1∶1的質量比混合溶解,再加入多壁碳納米管制備成紡絲液(制備過程見圖2(b))。該導電性人工神經導管呈黑色,能夠與神經殘端組織很好地融合。碳納米管的加入改善了復合支架的力學性能,一定程度上加速了神經的再生,但也明顯減緩了神經支架的降解速度。

3.3 其它制備方式

將碳納米管與高聚物混合后還可通過溶液澆鑄、浸提或涂覆等方法制成導電性神經導管。Zang等[37]將多壁碳納米管分散在明膠溶液中,然后涂覆在聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)基底表面上(見圖2(c)),制備了一種納米微孔支架。Mottaghitalab等[23]使用冷凍干燥和靜電紡絲聯合的方法制備了神經引導導管,首先通過冷凍干燥法構建絲素/單壁碳納米管(SF/SWCNT)基底,然后在其表面靜電紡取向的纖維連接蛋白納米纖維(FN),最后卷曲成神經導管(見圖2(d))[40]。溶液澆鑄法是將碳納米管和高聚物的混合溶液注入到設計好的模具中,然后讓其固化成型[34],因此也稱模具法。溶液澆鑄固化通常可采用冷凍干燥或光交聯固化等方法。Zhou等[36]將碳納米管和聚己內酯富馬酸酯(PCLF)混合溶液注入到玻璃模具中,并采用紫外線誘導的光交聯技術交聯聚合物(見圖2(e))。

4 高聚物/CNT復合神經導管的應用

高聚物/CNT復合神經導管具有較好的電學性能,有利于神經信號的傳遞,支持樹突延長和細胞黏附[41],能夠支持、促進和引導缺損的軸突末端的再生。由表1可以看到,復合碳納米管的神經導管材料具有較好的生物相容性,可以明顯促進雪旺細胞、PC12細胞、神經干細胞等細胞的黏附、生長、增殖。從表1的動物實驗可以看到,一般在12～16周神經再生基本完成,其功能基本得到恢復,導電復合神經導管在大鼠坐骨神經、背部神經等神經的損傷修復中表現出較好的神經再生效果。合適的電導率在神經再生修復過程中可以支持受損神經的電傳遞,促進神經元和軸突的生長,加快再生神經纖維的髓鞘化與功能恢復,從而促進神經肌肉再生[38],縮短神經再生修復的周期[18,23]。一般電導率在10-4～10-3S/m時,神經修復效果較好,過高的電導率反而會影響細胞活力,影響神經再生效果。

5 結束語

碳納米管的高強度、低質量、高導電性和生物相容性使其在生物傳感器[42-43]、生物電極[44]、生物顯像劑[28-29]、抗菌[45]和藥物輸送[46-47]等領域都有著重要的應用,特別是近年來碳納米管在人工神經導管中的應用漸成熱點。將高聚物和碳納米管復合材料用于周圍神經損傷修復的人工神經導管的研究中,應特別關注以下幾點。

1)碳納米管在神經修復中的突出作用:一是由于其特有的納米形貌有利于與神經細胞膜在納米尺度上作用,創造類細胞外基質環境,從而促進神經元黏附生長,因此,將碳納米管與高分子材料復合時應注意保留復合材料基質的納米形貌;二是碳納米管優異的電學性能可以促進軸突生長,且與電刺激協同作用可最大程度地發揮碳納米管在神經再生修復中的作用。

2)碳納米管雖然生物相容性較好,但是應用于生物體內時其細胞毒性與基因毒性仍然受到質疑,對碳納米管表面進行各種功能化改性不僅可改善其水溶性,提高可加工性,其細胞相容性也大大提高,且體內實驗也證實功能化的碳納米管可以更好地促進損傷神經的再生和修復。

3)將碳納米管與不同高聚物共混、交聯,采用不同方法可制備出不同結構的人工神經導管,應特別關注碳納米管的添加量以及神經導管的降解速度,以確保不會因降解產物短時間過量而引起代謝毒性。