一株PAHs 降解菌Bacillus halotolerans M-7 的篩選、鑒定及其特性

張世堂，胡澤祥，婁國生，張再美，高盛嵩，陳 爽

（1.92228 部隊，北京 100072；2.91286 部隊，山東青島 266021；3.中國石油大學（華東）化學化工學院，山東青島 266580）

航空煤油是一種重要的戰略資源，如果儲存不當就會受到微生物的污染。一方面，這些微生物污染會引發許多問題，如：燃料燃燒性能下降；燃料中微生物代謝產物可能會腐蝕貯藏設備、管道、氧化密封項圈，微生物的團簇也會造成飛機過濾器等的堵塞[1]，對航空煤油中主要的污染微生物進行研究，將有助于微生物污染的防治。而另一方面，這些微生物能夠在營養物質匱乏，氧氣濃度低的環境下生存，能夠利用并降解多種烴類，包括鏈烷烴、環烷烴甚至是難降解的多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等石油物質，其生物降解特性值得關注[2]。PAHs 是指含2 個或2 個以上苯環的芳烴，是一類有毒的有機污染物。在人類社會的發展過程中，人為造成的PAHs 排放量越來越大，主要是由于各種礦物燃料（如煤、石油和天然氣等）、木材、紙以及其他含碳氫化合物的不完全燃燒或在還原條件下熱解形成等[3]，其污染問題引起了世界各國的普遍重視。研究發現，隨著多環數目的增加，PAHs 的抗生物降解能力和致癌性會增大，且由于在許多生物鏈中都存在生物積累效應，導致PAHs 污染嚴重危害著土壤的生產、生態功能以及農產品質量和人類健康[4]。

有研究表明，微生物降解PAHs 是解決PAHs 污染最主要的途徑[5]。受烴類污染的土壤、海水或油品是高效降解菌株的主要來源。目前已知的能夠降解PAHs 的微生物包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和黃桿菌屬等[6-10]。孟建宇等[11]從烏梁素海水中篩選出一株假單胞菌，可降解質量濃度為3.5 g/L 的萘。馬丹[12]從含油廢水分離出一株菲降解菌，培養5 d后對菲的降解率為43.57%。但是，很少有降解菌能夠同時高效降解航空煤油和PAHs，對于降解PAHs 的研究也很少關注對同分異構體的降解效果。

本研究以污染的航空煤油為污染微生物來源，富集后通過平板分離法篩選得到降解菌，通過形態觀察、生理生化特征及16S rRNA 序列比對對篩選的降解菌進行鑒定，最后對該菌株降解不同種類PAHs 的能力進行了測定，以期為受PAHs 污染土壤的微生物降解提供微生物資源，同時鑒定航空煤油中的污染菌株并研究其降解特性，對減少航空煤油中微生物的污染和提高油品質量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養基

無機鹽培養基：磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸銨2.5 g、硫酸鈉1.0 g、無水氯化鈣0.1 g、無水硫酸鎂1.0 g、酵母粉0.1 g、氯化鈉30.0 g、乳酸鈉水溶液1.0 mL、磷酸氫二鉀0.5 g。加入適量去離子水，完全溶解后，定容至1 L。取若干250 mL 錐形瓶，每瓶分裝50 mL，121 ℃高壓滅菌20 min 備用。

篩選液體培養基：向滅菌后的50 mL 無機鹽培養基加入過濾器除菌的油品0.75 mL，即為篩選液體培養基。每50 mL 篩選液體培養基中加入0.9 g 瓊脂粉即為篩選固體培養基，121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）：稱取胰酪大豆胨液體培養基粉末30.0 g，加入適量去離子水，完全溶解后，定容至1 L。取若干250 mL 錐形瓶，每瓶分裝50 mL；每50 mL TSB 中加入0.9 g 瓊脂粉即為胰酪大豆胨固體培養基（TSA），121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

萘、蒽、菲降解培養基：以萘為例，用正己烷溶解固體萘，將其配制成1.0 g/L 的母液；向滅菌后的50 mL無機鹽培養基加入2.5 mL 的母液，使萘的工作濃度為50 mg/L。待正己烷揮發后即為萘降解培養基，蒽、菲降解培養基配制方法同萘。

1.2 降解菌的富集及篩選

在無菌環境下，用無菌的0.22 μm 濾膜抽濾4.0 L污染的油品，得到帶有菌體的濾膜，低溫環境下運輸至實驗室。用2.0 mL 無菌水沖洗上述濾膜，得到的菌懸液加至50 mL 篩選液體培養基中，放置于恒溫震蕩搖床中，35 ℃、165 r/min 培養至渾濁，同樣的條件轉接3次，經過富集最終得到能夠利用油品的微生物菌群。取富集液進行梯度稀釋，稀釋的菌液涂布于篩選固體培養基平板上，在35 ℃恒溫培養箱中培養48 h，直到長出單菌落，并對菌株進行劃線純化，得到的菌株即為初篩得到的降解菌。將初篩得到的降解菌接種至TSB中，35 ℃、165 r/min 活化12 h。按照1%的接種量將活化的種子液轉接至篩選液體培養基中，35 ℃、165 r/min條件下培養7 d，每組3 個平行，以不接種菌株的培養液作為對照。利用紫外分光光度法測定菌株對油品的降解率，根據降解率篩選獲得高效降解菌。

1.3 紫外分光光度法測定油品降解率

1.3.1 最佳吸收波長的確定 利用石油醚（60～90 ℃）（以下簡稱石油醚）作為萃取劑，萃取加入至篩選液體培養基中的油品，每次加入10.0 mL 的石油醚，在分液漏斗中靜置10 min，等待分層，收集有機相，以上步驟重復3 次，收集后的有機相稀釋至適當濃度后進行紫外全波長掃描。同時，配制1.0 g/L 的油品標準溶液，以石油醚為空白對照，在波長200～300 nm 的范圍內利用紫外可見分光光度計對萃取后溶液及1.0 g/L 的油品標準溶液的吸光度進行測定，確定最佳吸收波長[13]。

1.3.2 繪制標準曲線 配制濃度為100～1 000 mg/L的油品標準溶液，以石油醚為空白對照，利用紫外-可見分光光度計測定最佳吸收波長處的吸光值，以油品的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標來繪制標準曲線。

1.3.3 菌株降解率的測定 將降解菌接種至TSB 中，置于恒溫培養搖床中，在35 ℃、165 r/min 條件下活化12 h。將活化后的種子液按照1%的接種量轉接至篩選液體培養基中，35 ℃、165 r/min 條件下培養7 d，每組3 個平行，以不接種菌株的培養液作為對照。利用紫外分光光度法測定降解率，通過標準曲線計算油品的殘留量，借助公式（1）計算出菌株的降解率。

1.4 降解菌的鑒定

依據文獻《伯杰氏細菌鑒定手冊》[14]和博檢鑒定試劑盒中的使用說明對降解菌進行形態觀察和生理生化特性鑒定。提取M-7 的DNA，以細菌通用引物27F（5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、1492R（5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）分別為上下游引物[15]，進行PCR 擴增。PCR 反應體系總體積為20.00 μL，LA-Taq 酶0.25 μL，模板1.00 μL，無菌水5.25 μL，2×GC Buffer Ⅰ12.50 μL，dNTP 2.00 μL，上下游引物各0.50 μL。循環條件為95 ℃預變性300 s；95 ℃變性50 s；46.4 ℃退火45 s；72 ℃延伸90 s。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測上述PCR 產物。將條帶大小正確的PCR 產物送去北京擎科生物科技有限公司青島分公司進行測序。利用BLAST 比對已知微生物的16S rRNA 序列，分析得到同源序列。采用ClustalX2.0[16]和MEGA7.0[17]構建系統進化樹，采用鄰接法并通過自舉分析（1 000 次）進行置信度檢測。

1.5 氣相色譜法測定PAHs 降解率

首先繪制PAHs 標準曲線。以萘為例，配制濃度為20、40、60、80、100 mg/L 的萘標準溶液，利用氣相色譜法測定其峰面積。以萘的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。菲、蒽標準曲線的繪制方法同萘。氣相色譜條件如下：進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度330 ℃，毛細管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫130 ℃保持3 min，以45 ℃/min 的升溫速率升溫至180 ℃，保持5 min，再以45 ℃/min 的升溫速率升溫至280 ℃，保持5 min，進樣量1 μL[18]。

隨后，測定菌株對不同PAHs 的降解率。降解菌在TSB 中活化12 h 后，按照1%的接種量轉接至萘、蒽、菲降解培養基中，35 ℃、165 r/min 條件下培養6 d，每隔24 h 取樣，測定菌株的PAHs 降解率，具體方法包括：吸取5 mL 培養液加入裝有2.0 g 氯化鈉和10 mL正己烷溶液的離心管中，用旋渦混合器混勻2 min，7 000 r/min 離心10 min，轉移上清液至玻璃小瓶中。用2.0 g 無水硫酸鈉脫水，30 ℃旋轉蒸發，氮氣吹至1 mL以下，正己烷定容至1 mL[19]用氣相色譜儀測定各PAHs 的質量濃度。

2 結果分析與討論

2.1 建立紫外分光光度法測定油品的降解率

2.1.1 最佳吸收波長的確定 首先，利用紫外可見分光光度計對1.0 g/L 的油品標準溶液進行全波長掃描，結果見圖1，標準溶液在226 nm 和266 nm 處有最大吸收峰，隨后，用同樣的方法對萃取后的油品進行了全波長掃描，結果表明，二者最大吸收峰位置一致，證明該檢測方法適用于接下來油品降解率的測定。由于在200～238 nm 內石油醚的吸收性很強，容易干擾實驗測定結果[20]，為減少干擾而優選266 nm 為最佳吸收波長。

圖1 萃取后油品和油品標準液紫外全波長掃描結果

2.1.2 繪制標準曲線 以石油醚為空白對照，用紫外可見分光光度計測定266 nm 處的吸光度，以油品濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖2），得到線性方程為y=0.000 6x+0.021 9，相關系數R2=0.993，表明吸光度與油品濃度之間呈較好的線性關系，該方法可用于油品含量測定。

圖2 油品濃度-吸光度標準曲線

2.2 降解菌富集及篩選

從受污染的油品中初篩得到9 株能夠以油品為唯一碳源進行生長代謝的菌株，分別將其編號命名為：M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8、M-9。將9株菌株培養7 d 后，利用石油醚萃取殘余油樣，適當稀釋后測定266 nm 波長處的吸光度，根據標準曲線計算得到菌株降解后殘余油品的濃度，最后通過公式（1）計算各菌株的降解率，結果見圖3。9 株菌株對油品都具有一定的降解能力，其中菌株M-7 降解率最高，為99.00%，表現出高效降解混合油品的能力，因此，確定菌株M-7 為后續實驗菌株。

圖3 9 株菌株培養7 d 的油品降解率

2.3 降解菌M-7 的鑒定

對菌株M-7 在TSA 上的菌落形態進行觀察，結果見圖4a，菌落呈乳白色、粗糙、不透明狀，邊緣不規則，與芽孢桿菌的形態特征相似。掃描電鏡圖顯示M-7 為短而小的桿菌，見圖4b。隨后，對該菌株進行生理生化鑒定，結果見表1。菌株M-7 對β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鹽利用、硫化氫產生、VP、氧化酶的實驗結果為陽性，其余實驗結果均為陰性，說明菌株M-7 可產生β-半乳糖苷酶、脲酶、氧化酶，能夠利用葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鹽產酸，可分解含硫氨基酸產生硫化氫等，實驗結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》和王青華等[21]報道的芽孢桿菌的生化結果相似。

表1 生理生化鑒定結果

圖4 a.M-7 菌落形態和b.掃描電鏡形態觀察

最后，對該菌株進行遺傳學鑒定。提取菌株基因組，經PCR 擴增得到1 300 bp 左右的條帶并進行測序。通過BLAST 對測序結果進行同源比對，利用ClustalX2.0 和MAGE7.0 構建系統進化樹（圖5），菌株M-7 與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株Bacillus halotolerans的16S rRNA 序列同源性最高，達到了99.86%，因此，確定該菌株為Bacillus halotolerans，將其命名為Bacillus halotolerans M-7。

圖5 M-7 菌株系統進化樹

2.4 氣相色譜法測定PAHs 降解率

2.4.1 PAHs 標準曲線繪制 配制不同濃度的萘、蒽、菲標準溶液用氣相色譜法分別測定峰面積，分別作出萘、蒽、菲濃度-峰面積標準曲線，見圖6，萘的線性方程為y=180.500 0x+520.000 0，R2=0.996；蒽的線性方程為y=635.357 1x+1 562.857 1，R2=0.997；菲的線性方程為y=498.228 7x+495.238 1，R2=0.991，相關系數都大于0.990，線性關系較好。

圖6 a.萘、b.蒽和c.菲的標準曲線

2.4.2 降解菌對PAHs 萘、蒽、菲的降解性能測定Bacillus halotolerans M-7 對三種PAHs 都有不同程度的降解（圖7）。該菌株對二環芳烴萘的降解率最高，第1 d 的降解率就能達到60.00%以上，第6 d 幾乎全部降解。但是，對三環芳烴的降解率要低。蒽在前4 d 的降解率幾乎為0，4 d 之后才開始有所降解，這可能是因為50 mg/L 的蒽在作為唯一碳源和氮源的情況下，不足以支撐菌株的快速生長，因此，Bacillus halotolerans M-7 在前4 d 的代謝十分緩慢，需要經歷較長的遲滯期才進入快速生長的對數期。同樣的，該菌株對蒽的同分異構體菲的降解也出現類似現象。隨著培養時間的延長，蒽和菲開始被降解，在第6 d 時，降解率分別為39.89%、47.69%，且降解率依然呈現上升趨勢。對比該菌株對不同環數的PAHs 的降解能力發現，Bacillus halotolerans M-7 對二環芳烴萘的降解率明顯優于對三環芳烴蒽和菲，根據思顯佩等[22]的研究，推斷PAHs苯環的斷開主要是靠加氧酶的作用，加氧酶把氧加到C-C 鍵上形成C-O 鍵，經加氫、脫水等作用使C-C 鍵斷裂，從而使苯環數減少，因此，推斷苯環越多越難降解。故該菌株對于兩環的萘的降解效果優于三環的蒽、菲。對于相同環數的蒽和菲而言，該菌株對菲的降解要優于對蒽的降解。劉俊等[23]研究發現乳白耙齒菌F17 對菲的降解效果比蒽要好，杜麗娜等[24]同樣發現青頂擬多孔菌對菲的降解能力要優于蒽的降解，這與本實驗結果一致。這種差異顯然是由于菲和蒽分子結構的不同所引起[23]，蒽和菲3 個苯環的位置不同而有著不同的降解途徑。

圖7 Bacillus halotolerans M-7 對萘、蒽、菲的降解性能

3 結論

本文從污染的航空煤油中篩選獲得1 株能夠高效降解航空煤油混合物和PAHs 的菌株，通過形態觀察、生理生化特征及16S rRNA 序列分析對篩選的降解菌進行鑒定，最后對該菌株降解不同種類PAHs 的能力進行測定，主要得出以下結論：

（1）從污染的油品中篩選出9 株能夠高效降解油品混合物的菌株，9 株菌株對油品的降解率都在80.00%以上。通過二次篩選，篩選出1 株表現較好的M-7 菌株，其對油品的降解率達到99.00%以上。通過形態觀察、生理生化實驗及16S rRNA 序列比對對菌株進行鑒定，該菌株屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillus halotolerans M-7。

（2）利用氣相色譜法檢測該菌株對不同PAHs 的降解率，結果表明，培養7 d 后，Bacillus halotolerans M-7 對萘、蒽、菲的降解率分別為99.26%、39.89%、47.69%，其中二環芳烴萘的降解率明顯優于三環芳烴的蒽和菲，同為三環芳烴的同分異構體蒽和菲，對菲的降解率大于蒽，表明該菌株對于同分異構體的降解具有不同的途徑。

本研究為受PAHs 污染土壤的微生物降解提供了微生物資源，同時鑒定航空煤油中的污染菌株并研究其降解特性，對減少航空煤油中微生物的污染和提高油品質量有重要意義。