纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種居群間核型變異研究

方忠艷 朱明昆 包俊浩 龐菁璐 張亞洲 康厚揚(yáng) 吳丹丹

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，成都611130）

鵝 觀 草 屬（Roegneria）是 小 麥 族（Triticeae Dumortier）中最大屬，該屬包含異源四倍體和異源六倍體，基因組符號(hào)為StY 或StStY?，F(xiàn)知全世界約有130 余種，廣泛分布于北半球的溫寒地帶。我國(guó)約有70 余種，主要分布于西北、西南和華北地區(qū)[1]。纖 毛 鵝 觀 草（Roegneria ciliaris，StY，2n=4x=28）是鵝觀草屬多年生異源四倍體物種，有纖毛鵝觀草原變種（R.ciliarisvar.ciliaris）、阿穆?tīng)桖Z觀草變種（R.ciliarisvar.amurensi）和豎立鵝觀草變種（R.ciliarisvar.japonensis）3 個(gè)變種，在我國(guó)有廣泛的分布[1-2]。纖毛鵝觀草是優(yōu)良的牧草植物，贛飼一號(hào)纖毛鵝觀草是我國(guó)第一個(gè)選育并登記的纖毛鵝觀草牧草新品種[3]。纖毛鵝觀草是栽培小麥的三級(jí)基因資源庫(kù)，在小麥遺傳改良中具有重要價(jià)值，它具有抗赤霉病、白粉病、條銹病及抗非生物逆境等優(yōu)良性狀。前人通過(guò)纖毛鵝觀草與普通小麥雜交，將含有抗病抗逆基因的染色體轉(zhuǎn)入普通小麥，并創(chuàng)制鑒定出普通小麥—纖毛鵝觀草二體異附加系等異染色體系種質(zhì)資源[4-7]。然而，纖毛鵝觀草存在3 個(gè)變種，變種在自然中存在不同來(lái)源的居群，這些變種之間和居群之間的遺傳多樣性和染色體水平的變異也尚不明了，使纖毛鵝觀草的有效利用受到限制。

植物染色體核型分析是對(duì)植物染色體數(shù)量及結(jié)構(gòu)變異、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行定量和定性的描述，是對(duì)物種親緣關(guān)系與進(jìn)化程度的表達(dá)的重要方法[8]。盧寶榮等[9]對(duì)纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草的形態(tài)學(xué)比較、核型分析和染色體組進(jìn)行分析，認(rèn)為纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草應(yīng)為一個(gè)物種的兩個(gè)變種，以纖毛鵝觀草為原變種，而豎立鵝觀草為纖毛鵝觀草的一個(gè)變種。魏秀華等[10]對(duì)纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草不同居群的染色體核型進(jìn)行研究，表明兩個(gè)材料核型特征有很大的相似性且兩個(gè)材料的不同居群間存在豐富的遺傳多樣性?；蚪M熒光原位雜交（GISH，Genomic in situ hybridization）和熒光原位雜交（FISH，F(xiàn)luorescence in situ hybridization）技術(shù)是識(shí)別小麥族物種染色體組和單條染色體的重要手段。Wang等[11]利用質(zhì)粒pCbTaq4.14 DNA，在纖毛鵝觀草的1St、2St、3St、7St 染色體上檢測(cè)到FISH 信號(hào)。利用pTa794、pTa71、RcAfa 和（GAA）10，Kong 等[6]在一整套小麥-纖毛鵝觀草異附加系中構(gòu)建了纖毛鵝觀草的14 條染色體的FISH 核型。程夢(mèng)豪等[12]、Cheng 等[13]利用前期開(kāi)發(fā)的St 基因組特異性探針oligo-2ScL-163，結(jié)合oligo-pAs1、（GAA）10、黎巴嫩擬鵝觀草（St 基因組）DNA 進(jìn)行FISH 和GISH 對(duì)纖毛鵝觀草品系建立核型，通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同品系FISH核型分布特征和分子標(biāo)記分析，揭示了不同纖毛鵝觀草品系染色體水平具有豐富的遺傳多樣性以及染色體的結(jié)構(gòu)重排。但是，目前關(guān)于纖毛鵝觀草種下水平的染色體FISH 核型研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

鵝觀草屬的St 和Y 基因組親緣關(guān)系較近，雙色GISH 在區(qū)分僅含有鵝觀草屬物種中的St 和Y 染色體上仍有難度。Wang 等[14]篩選了新的St 基因組標(biāo)記St2-80，用于區(qū)分小麥族中的St 和其他基因組，尤其是區(qū)分鵝觀草屬物種中的St 和Y 基因組。目前鵝觀草屬中Y 亞基因組的起源尚不清楚，因此專門針對(duì)鵝觀草屬的St 和Y 亞基因組開(kāi)發(fā)的探針數(shù)量極為有限。Wu 等[15]利用纖毛鵝觀草（StY）和St 基因組同源四倍體糙緣擬鵝觀草進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，篩選開(kāi)發(fā)了St 和Y 基因組富集的重復(fù)序列探針StY_34、StY_90、StY_93、StY_107，鑒定大鵝觀草（R.grandis）的核型。因此可以利用這4個(gè)St 和Y 基因組重復(fù)序列探針結(jié)合St2-80 和45S rDNA 對(duì)纖毛鵝觀草種下水平的染色體結(jié)構(gòu)變異開(kāi)展進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)纖毛鵝觀草的纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種共15 份居群材料的染色體長(zhǎng)短臂進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算染色體核型參數(shù)；同時(shí)利用StY_34、StY_90、StY_93、StY_107、45S rDNA、St2-80 6個(gè)重復(fù)序列探針，對(duì)15 種不同來(lái)源材料進(jìn)行FISH核型分析，建立FISH 核型圖和模式圖，比較分析不同來(lái)源的纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種的染色體核型差異，為了解纖毛鵝觀草以及鵝觀草屬野生材料染色體特征提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料本試驗(yàn)包含纖毛鵝觀草的2 個(gè)變種R.ciliarisvar.ciliaris和R.ciliarisvar.japonensis共15 份居群材料，物種名、材料編號(hào)、染色體數(shù)目和基因組組成、采集地列于表1。所有材料來(lái)自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，材料均種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所種質(zhì)資源圃，憑證標(biāo)本保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所標(biāo)本室（SAUTI）。

表1 供試材料

1.2 有絲分裂中期染色體制備和染色體核型分析染色體制片和染色體長(zhǎng)度測(cè)量參照Wu 等[16]方法進(jìn)行。其中核型公式、平均臂比、染色體長(zhǎng)度比、臂比大于2 的比例參照李懋學(xué)等[8]的方法計(jì)算，核型不對(duì)稱系數(shù)按Arano[17]的方法計(jì)算，分類標(biāo)準(zhǔn)依照Stebbins[18]的方法進(jìn)行分類。

1.3 探針標(biāo)記、FISH 和顯微鏡檢查St2-80[14]、45S rDNA[19]、StY_90、StY_34、StY_107 和 StY_93[15]6 個(gè)探針用于鑒定纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草染色體。以普通小麥（中國(guó)春）和纖毛鵝觀草的基因組DNA 為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別擴(kuò)增 45S rDNA 和St、Y 基因組富集型探針。 StY_93 探針用6-FAM（6-carboxy - fluorescein）標(biāo)記（TAMRA；Sangon Biotech，中國(guó)上海），其余探針均由DNA 使用Atto 488 NT Labeling Kit（PP-305L-488） 和Atto 550 NT Labeling Kit（PP-305L-550）（Jena Bioscience，Jena，Germany）試劑盒將重復(fù)序列標(biāo)記成探針。FISH 探針的雜交按照 Wu 等[15]的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。在18μL 雜交緩沖液中加不同色素?zé)晒鈽?biāo)記探針各1μL，制備總共20μL 的雙色FISH雜交溶液。將20μL 雜交混合溶液置于90℃變性爐上變性10min。雜交混合液添加到載玻片上，用25mm×25mm 蓋玻片覆蓋，于80℃變性爐上變性90s，將處理好的載玻片在37℃的黑暗潮濕環(huán)境中培養(yǎng)6～8h。雜交后的載玻片在55℃的2×SSC 中洗滌20min，用75%、85%和100%梯度酒精脫水各1min，干燥后在黑暗環(huán)境中滴加10～15μL 的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），蓋上蓋玻片，即可在BX63 熒光顯微鏡下觀察。熒光觀察拍照后去除蓋玻片，將標(biāo)本載玻片在2× SSC 中煮沸20min，75%、80%和100%梯度酒精中脫水10min，風(fēng)干，然后將載玻片暴露在強(qiáng)烈的陽(yáng)光下至少48h 后即可進(jìn)行連續(xù)FISH 雜交，方法與上述雜交方法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖毛鵝觀草原變種與豎立鵝觀草變種核型數(shù)據(jù)15 份居群材料染色體數(shù)目都為28 條；核型類型均為2A；染色體主要由中部著絲粒染色體（11～12 對(duì)）和近中部著絲粒染色體（2～3 對(duì)）組成；含2 對(duì)隨體染色體。纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草居群間核型差異主要在核型公式、平均臂比、染色體長(zhǎng)度比、臂比＞2 的比例、核不對(duì)稱系數(shù)等方面，如表2 所示。纖毛鵝觀草原變種居群間平均臂比的變化范圍為1.29～1.40；染色體長(zhǎng)度比的變化范圍為1.65～1.80；臂比＞2 的比例為0.07 或0.14；核不對(duì)稱系數(shù)為0.51～0.57。豎立鵝觀草變種居群間的平均臂比變化范圍為1.21～1.38，染色體長(zhǎng)度比變化范圍為1.59～1.75；臂比＞2 的比例為0.07 或0.14；核不對(duì)稱系數(shù)為0.54～0.62。其中，同一采集地的不同居群豎立鵝觀草變種材料的核型數(shù)據(jù)也存在差異，如采集地是四川宜賓編號(hào)為88-89-252、88-89-263、88-89-261 的3 份材料，其核型公式分別為2n=4x=28=24m（2sat）+4sm（2sat）、2n=4x=28=22m（4sat）+6sm、2n=4x=28=24m（4sat）+4sm；平均臂比分別為1.21、1.36、1.38；染色體長(zhǎng)度比分別為1.59、1.75、1.72；臂 比＞2 的 比 例 分 別 為0.07、0.14、0.14；核不對(duì)稱系數(shù)分別為0.54、0.57、0.57。

表2 供試材料染色體參數(shù)

2.2 纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種分子FISH 核型建立利用 StY_34、StY_90、StY_93、StY_107、St2-80、45S rDNA 對(duì)15 份不同居群材料的根尖有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)FISH 建立FISH 核型（圖1）。首先，將St2-80 和45S rDNA 進(jìn)行FISH 雜交分別用于區(qū)分St 染色體和核仁組織區(qū)（NORs）。在15 份居群材料中，有14 條染色體除了近著絲粒區(qū)域外，整個(gè)染色體都顯示出St2-80 信號(hào)為St 染色體，其余14 條僅在染色體端部區(qū)域顯示出熒光信號(hào)為Y 染色體，St 和Y 染色體上分別有1 對(duì)染色體產(chǎn)生45S rDNA 的信號(hào)。其次，使用StY_107 和StY_93 重復(fù)序列對(duì)相同有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行了FISH 檢測(cè)。StY_107 與染色體端部、近端部以及靠近著絲粒區(qū)域雜交產(chǎn)生信號(hào)，而StY_93則主要在（近）著絲粒區(qū)域顯示強(qiáng)烈信號(hào)，在遠(yuǎn)端區(qū)域顯示分散信號(hào)。最后，使用StY_90 和StY_34 重復(fù)序列對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行FISH 檢測(cè)，結(jié)果顯示染色體端部區(qū)域有強(qiáng)烈信號(hào)。根據(jù)相對(duì)長(zhǎng)度和FISH 信號(hào)分布模式，用編號(hào)Ⅰ-Ⅶ任意指定了標(biāo)記良好的染色體。

圖1 纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種居群間FISH 核型圖

在9 份纖毛鵝觀草原變種居群材料中除St2-80 以外的5 個(gè)重復(fù)序列探針，共雜交產(chǎn)生了755對(duì) 信 號(hào)，45S rDNA、StY_93、StY_107、StY_34、StY_90 分別產(chǎn)生36、216、191、220、92 對(duì)信號(hào)；在6 份豎立鵝觀草變種居群材料中除St2-80 以外的5 個(gè)重復(fù)序列探針，共雜交產(chǎn)生了458 對(duì)信號(hào)，45S rDNA、StY_93、StY_107、StY_34、StY_90分別產(chǎn)生24、137、116、126、55 對(duì)信號(hào)。6 個(gè)重復(fù)序列在纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種上的分布模式大致相同，但染色體上探針雜交信號(hào)的強(qiáng)弱存在差異，如探針StY_107 在纖毛鵝觀草原變種的ⅠSt 上的雜交信號(hào)普遍強(qiáng)于豎立鵝觀草變種，探針StY_93 在豎立鵝觀草的Ⅵ St 染色體上出現(xiàn)的信號(hào)普遍強(qiáng)于纖毛鵝觀草原變種。為了更直觀準(zhǔn)確地描述除St2-80 探針外的5 個(gè)探針的雜交信號(hào)在15 份居群材料的14 對(duì)染色體上的分布模式，建立了它們的FISH 核型模式圖，對(duì)15 份居群材料的染色體上出現(xiàn)雜交信號(hào)位置和頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并將出現(xiàn)信號(hào)的頻率和位置標(biāo)注到相應(yīng)染色體上構(gòu)建了居群總的“泛FISH 核型”信號(hào)分布圖（圖2-A），“泛FISH 核型”顯示探針更容易在纖毛鵝觀草原變種染色體上產(chǎn)生特異的雜交位點(diǎn)，此外探針在豎立鵝觀草變種的Y 染色體上也更容易出現(xiàn)特異的雜交位點(diǎn)。將染色體上出現(xiàn)頻率≥ 50.0%的雜交信號(hào)構(gòu)建居群“核心FISH 核型”（圖2-B）?！昂诵腇ISH核型”顯示了34 個(gè)FISH 信號(hào)：2 個(gè)45S rDNA 信號(hào)、12 個(gè)StY_34 信 號(hào)、7 個(gè) StY_90 信 號(hào)、9 個(gè)StY_93 信號(hào)和4 個(gè)StY_107 信號(hào)。不同染色體的信號(hào)數(shù)量從0 到5 個(gè)不等，其中3 St 的信號(hào)最少（0個(gè)），4 St 和5 Y 信號(hào)最多（5 個(gè)）。“核心FISH 核型”只顯示保守信號(hào)，因此更具有代表性并幫助確定纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草染色體的身份。

圖2 纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種的“泛 FISH 核型 ”（A）和 “核心 FISH 核型”（B）

2.3 纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種分子FISH 核型比較分析為了描述探針FISH 信號(hào)在不同居群間的多態(tài)性，對(duì)15 個(gè)居群的FISH 核型進(jìn)行了比較分析（圖3）。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)15 個(gè)居群的St 和Y 染色體上共發(fā)現(xiàn) 61 個(gè)染色體FISH 信號(hào)差異，其中Y 染色體的差異（33 個(gè)）大于St 染色體的差異（28 個(gè)）。在 St 亞基因組中，Ⅶ St 染色體對(duì)的變異最大（9 個(gè)），Ⅱ-Ⅵ St 均含有3 個(gè)染色體變異類型，而在Y 亞基因組中V Y 染色體對(duì)的變異最少（3 個(gè)），Ⅰ Y 和Ⅶ Y 的變異最多（6 個(gè)）。

圖3 纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種居群間FISH 核型比較圖

3 討論

纖毛鵝觀草具有豐富遺傳多樣性。前人對(duì)纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種的核型進(jìn)行了大量的研究。如蔡聯(lián)炳等[20]以及孫義凱等[21]對(duì)纖毛鵝觀草的核型進(jìn)行了報(bào)道，核型公式分別為2n=4x=28=20m + 8sm（4SAT），2n=4x=28=22m（2SAT）+6sm（2SAT），但是他們沒(méi)有對(duì)纖毛鵝觀草變種材料核型進(jìn)行區(qū)分；盧寶榮等[9]和魏秀華等[10]報(bào)道了纖毛鵝觀草的變種材料纖毛鵝觀草原變種和豎立鵝觀草變種的核型公式，但是核型公式間存在差異。本試驗(yàn)中纖毛鵝觀草原變種的核型公式為2n=4x=28=22m（4sat）+6sm、2n=4x=28=22m（2sat）+6sm（2sat）或2n=4x=28=24m（4sat）+4sm；豎立鵝觀草變種的染色體核型公式為2n=4x=28=24m（4sat）+4sm、2n=4x=28=24m（6sat）+4sm、2n=4x=28=22m（4sat）+4sm、2n=4x=28=24m（2sat）+4sm（2sat）或2n=4x=28=22m（4sat）+6sm，與前人已報(bào)道的核型公式存在差異，這可能與試驗(yàn)材料的采集地、試驗(yàn)方法有關(guān)。纖毛鵝觀草原變種、豎立鵝觀草變種以及兩個(gè)變種的居群材料間在平均臂比、染色體長(zhǎng)度比、核不對(duì)稱系數(shù)、臂比＞2 的比例存在差異，且同一變種來(lái)自同一地方的不同居群間也存在一定的差異，表明纖毛鵝觀草種下水平存在豐富的遺傳多樣性。

本研究利用FISH 技術(shù)對(duì)纖毛鵝觀草物種的變種材料染色體進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析，為纖毛鵝觀草物種種下水平的遺傳多樣性提供參考依據(jù)。結(jié)果表明這6 個(gè)重復(fù)序列探針在這2 個(gè)變種的15 份居群材料中的分布模式基本相似但也存在差異，且豎立鵝觀草變種的同源染色體變異的頻率（33.3%）大于纖毛鵝觀草原變種（0）。近年來(lái)，關(guān)于St 和Y 亞基因組的染色體結(jié)構(gòu)變異展開(kāi)了大量的研究，如Liu 等[22]利用FISH 和GISH 技術(shù)表征了不同鵝觀草屬物種（StY）的St 基因組和Y 基因組核型以探究不同StY 物種間的基因組分化；Dou等[23-24]在披堿草屬物種Elymus nutans（StYH）中發(fā)現(xiàn)St 和Y 染色體存在豐富的染色體結(jié)構(gòu)變異，且St 亞基因組的變異少于Y 亞基因組；Cheng等[13]對(duì)53 個(gè)野生纖毛鵝觀草（R.ciliaris）品系建立FISH 核型發(fā)現(xiàn)了纖毛鵝觀草存在豐富的染色體結(jié)構(gòu)變異，且Y 基因組的染色體變異較多。本研究通過(guò)FISH 核型比較分析結(jié)果表明纖毛鵝觀草種下水平的居群材料間具有豐富的變異，且Y 亞基因組的變異多于St 亞基因組，這同樣也表明了纖毛鵝觀草和豎立鵝觀草具有豐富的遺傳多樣性。

植物染色體FISH 核型圖的建立在植物分類及進(jìn)化研究和植物育種特別是植物遠(yuǎn)緣雜交育種中具有重要的作用。本研究通過(guò)連續(xù)FISH，對(duì)出現(xiàn)頻率≥50.0%的雜交信號(hào)構(gòu)建纖毛鵝觀草與豎立鵝觀草的“核心FISH 核型”，為纖毛鵝觀草原變種與豎立鵝觀草變種的染色體結(jié)構(gòu)變異提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，也為遠(yuǎn)緣雜交育種產(chǎn)生的小麥-纖毛鵝觀草異附加系中纖毛鵝觀草的染色體鑒定提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

纖毛鵝觀草作為小麥的三級(jí)基因資源庫(kù)含有優(yōu)異的抗病和抗逆基因，但關(guān)于纖毛鵝觀草變種之間和居群之間的遺傳多樣性和染色體水平的變異的研究較少，使纖毛鵝觀草的有效利用受到限制。本研究通過(guò)染色體核型和分子FISH 核型揭示了纖毛鵝觀草種下水平具有豐富遺傳多樣性和染色體結(jié)構(gòu)變異，并建立了種下變種纖毛鵝觀草變種和豎立鵝觀草變種的“核心FISH 核型”，為了解纖毛鵝觀草以及鵝觀草屬野生材料染色體特征提供依據(jù)，同時(shí)也為纖毛鵝觀草的進(jìn)一步利用提供了染色體水平依據(jù)。