UPLC-Q-TOF/MS 結合網絡藥理學和分子對接技術探討山豆根抗肝癌的藥效物質及作用機制*

王曉雯，張月，胡璐瑤，舒樂新，劉艷普，魏金霞，程文播，蔡挺

（1.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；2.山東廣通寶醫藥有限公司，青州 262500；3.天津市醫用質譜精準診斷企業重點實驗室質譜應用中心，天津 300399；4.中國科學院大學寧波華美醫院，寧波 315010）

原發性肝癌在臨床上屬于常見惡性腫瘤，是中國第2 位腫瘤致死病因[1]。肝癌患者缺乏特異性篩選方法且早期癥狀缺乏典型性，大多數患者在診斷時已經處于晚期狀態，處于肝癌晚期的患者5 年內的生存率下降到2%[2-3]。近幾十年，治療肝癌已采用局部消融術和經肝動脈化療栓塞術等非根治性治療，以及靶向治療及免疫治療等[4]，但是還存在著遠期療效與復發風險的局限性。因此，探索有效的肝癌治療方法和藥物仍是目前首要的問題。近年來，中醫藥由于具有多成分、多靶點、多途徑的優勢，被廣泛認可用于肝癌治療，可以減少疾病的復發[5]。肝癌的病因，綜合各醫家的中醫理論，主要包括正氣虧虛、肝脾失調、癌毒、脾虛等[6]。不同病因引起的肝癌采用不同的治療方法，正氣虧虛導致的肝癌應該扶正祛邪，用活血化瘀、疏肝行氣、補腎益精等中藥；癌毒類導致的肝癌應用清熱 解毒、化瘀軟堅等中藥；脾虛導致的肝癌應該益氣健脾，用清熱利濕、疏肝理氣等中藥[7]。山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖，具有清熱解毒，消腫利咽的功效。目前藥理研究報道，山豆根不僅有抗炎、保肝等作用，還有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管系統等藥理作用。其中許多研究表明，山豆根具有很好的抗肝癌作用，研究發現山豆根提取物能夠抑制人肝母細胞瘤HepG2 細胞、人肝癌Hep3B 細胞的增殖，山豆根生物堿能產生明確的體內抗肝腫瘤藥理作用[8-12]。然而，目前山豆根抗肝癌作用的物質基礎及作用機制尚不十分明確。

超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術與傳統的高效液相相比，具有小顆粒高性能微粒固定相、超高壓輸液泵，其具有分析速度快、質量精度高、靈敏度高和分辨率高等特點[13]。UNIFI 1.8 軟件配有天然產物數據庫，該庫中有6 000 多種組分，與UPLC-Q-TOF/MS 配合使用，代替了傳統的人工提峰、計算分子式及分析碎片斷裂情況的模式，有利于更高效率地識別中藥中的復雜化學成分及其化學結構，為研究中藥藥效的物質基礎提供了強有力的技術支持[14-16]。網絡藥理學利用復雜的網絡模型建立藥物、靶點與疾病間的相互作用網絡，是多數據、多學科融合的產物，表明了中藥的多成分、多靶點的作用特點，適合運用于探索中藥藥理作用的作用靶點以及作用機制[17-19]。

因此，本研究利用UPLC-Q-TOF/MS 結合UNIFI 1.8 軟件快速鑒定山豆根的化學成分，通過應用網絡藥理學結合分子對接技術篩選出山豆根抗肝癌的活性成分及核心靶點，以及細胞活性實驗驗證相關成分的抗肝癌作用，從分析化學成分和網絡藥理學角度進而探究山豆根抗肝癌作用的藥效物質基礎以及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 化學成分分析部分

1.1.1 藥材、試劑和儀器 山豆根飲片（安國藥材市場，批號：2020G10111），經天津中醫藥大學中藥學院李天祥教授鑒定為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖；色譜級甲醇、乙醇（賽默飛世爾科技有限公司）；超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Xevo G2 Q-TOF 質譜儀（美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC 型二元泵和樣品管理器（美國Waters 公司）；色譜柱[美國Waters 公司ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）]；SB-120DT 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；H1750R 離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.1.2 實驗方法 稱取山豆根飲片50 g，用4 倍量的95%乙醇溶劑加熱回流提取3 次，濾渣用4 倍量的75%乙醇溶劑加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，在4 ℃以12 000 r/min，離心 15 min（離心機半徑為8.5 cm），取上清液，旋蒸揮發至干[20-21]。取山豆根浸膏50 mg，置于50 mL 的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲30 min，取上清液，經0.22 μm 濾膜過濾，待進樣。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%甲酸水（B）；梯度 洗脫（0～1 min，10% A；1～21 min，10% A～100% A；21～22 min，100% A）。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。質譜條件：系統采用電噴霧離子源正、負離子模式采集數據，掃描范圍m/z 100～1 500，錐孔電壓40 V，毛細管電壓3 000 V，離子源溫度 120 ℃，脫溶劑氣體流速800 L/h，錐孔反吹氣50 L/h[22]。

運用UPLC-Q-TOF/MS 技術采集數據后，采用UNIFI1.8 軟件自動識別化學成分。首先查閱文獻[23]，補充原有的山豆根化合物數據庫；建立山豆根正負離子模式下的分析方法；再將原始質譜數據導入UNIFI1.8 軟件中，進行分析，UNIFI1.8 軟件對數據進行自動篩查、鑒定；之后將所得數據進行過濾篩選，設定質量誤差為±10×10-6；最后結合相關文獻各化合物的保留時間，以及碎片離子理論質量數、保留時間和分子式，對各化合物進行人工識別和鑒定。

1.2 網絡藥理學研究方法[24-25]

1.2.1 山豆根化學成分作用靶點的預測與篩選 鑒定所得到的化學成分在PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載相應的2D 結構圖，未查到的化學成分結構通過查閱文獻用ChemDraw作圖保存為SDF 結構，將結構導入PharmMapper 數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預測靶點，并借助UniProt（https：//www.uniprot.org/）將靶點蛋白名稱轉化為對應的基因名（Gene Symbol），篩選并刪除重復靶點。

1.2.2 肝癌疾病靶點的預測與篩選 在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）及DrugBank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）以“liver cancer”為關鍵詞檢索，合并2 個數據庫的結果，并借助UniProt（https：//www.uniprot.org/）將靶點蛋白名稱轉化為對應的官方基因名（Gene Symbol），篩選并刪除重復靶點，得到肝癌治療靶點。

1.2.3 韋恩圖、蛋白質相互作用（PPI）網絡及活性成分-交集靶點網絡構建 使用韋恩作圖平臺繪制出肝癌疾病和山豆根化學成分靶點的韋恩圖，并通過String（https：//www.stringdb.org/）數據庫，構建PPI 分析網絡。用Cytoscape3.7.2 篩選出度值排名前5 位的靶點為山豆根抗肝癌的核心 靶點。繼續用Cytoscape3.7.2 構建化學成分-交集靶點網絡圖，其中度值排名前6 位的化學成分即為核心活性成分。

1.2.4 生物信息分析 將交集靶點導入DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進行基因本體分析（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集通路分析，并通過微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對其為生物過程（BP），細胞組件（CC），分子功能（MF）各自顯著性前10 位的結果以及KEGG顯著性前20 位的條目進行可視化，以柱狀圖和富集氣泡圖進行展示。最后在Cytoscape 3.7.2 軟件中構建“成分-靶點-通路”網絡。

1.2.5 分子對接驗證 利用TCMSP 數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）下載山豆根主要活性成分的mol 2 格式的分子結構。利用RCSB PDB 蛋白數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 網絡中度值前5 位的靶點蛋白的PDB 格式的3D 晶體結構。通過運行Autodock Vina 進行分子對接。采用PyMOL軟件將分子對接結果可視化。

1.3 噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞活性

1.3.1 細胞、主要試劑與儀器 人肝癌細胞（HepG2，武漢普賽諾公司）；三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿（成都埃法生物科技有限公司）；二甲基亞砜（賽默飛世爾科技有限公司）；胎牛血清、青鏈霉素混合液（Gibco 公司）；DMEM 培基（BI 公司）；磷酸緩沖液（1×，pH=7.2～7.4）（索萊寶生物科技有限公司）；AII 級生物安全柜（海爾公司）；倒置顯微鏡（Nikon TS2）；酶標儀（BioTek 公司）。

1.3.2 細胞培養 HepG2 細胞置于5% CO2，37 ℃恒溫培養箱中，在添加10%胎牛血清的DMEM 培養基中生長，以傳代后狀態較好的細胞進行實驗。

1.3.3 細胞活性檢測 設置分組為10 組，包括空白組，三葉豆紫檀苷組（0.4、0.9、1.4 mmol/L），氧化苦參堿組（4.5、6、7.5 mmol/L），苦參堿組（4.8、6.4、8 mmol/L）。取對數生長期細胞，以5×104/孔的細胞懸液100 μL 接種于96 孔培養板中，每組6 個復孔，培養24 h。棄去培養基，各濃度藥物以每孔100 μL 加入預先培養的細胞中，培養24 h。棄去培養基，加入100 μL 的5%MTT 溶液于各孔中，于5% CO2，37 ℃恒溫培養箱中繼續孵育3 h。棄上清液，各孔中分別加入150 μL 的DMSO，低速轉動10 s，使結晶全部溶解，在酶標儀上測定490 nm 的吸光度 OD 值，計算細胞存活率。公式如下：

細胞存活率%=OD實驗組/OD空白組×100%。

2 結果

2.1 化學成分分析部分 采用UPLC-Q-TOF/MS技術對山豆根提取物進行檢測分析，結果分別得到正、負離子模式下的基峰圖（見圖1）。采用UNIFI 1.8 軟件進行分析，以及與相關文獻比對共鑒定出23 個化合物。包括吡啶類生物堿9 個，異黃酮類化合物3 個，二氫黃酮類化合物4 個，二氫異黃酮類化合物2 個，黃酮醇類化合物1 個，苯并呋喃類化合物2 個，蒽醌類化合物1 個，木脂素類化合物1 個，并得到各化學成分的保留時間、m/z 值、碎片離子等。數據見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

圖1 山豆根負離子模式（A）和正離子模式（B）的BPI 圖Fig.1 BPI diagram of Sophora tonkinensis in negative ion(A)and positive ion(B)mode

2.1.1 吡啶類生物堿類化合物

2.1.1.1 苦參堿類 從山豆根中共鑒定出苦參堿類5 個，包括5α-羥基萊曼堿、苦參堿、5α，14β-二羥基苦參堿、7，11-去氫苦參堿、氧化苦參堿。以化合物3為例，在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物3 為5α-羥基萊曼堿，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 263.177 0[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有138.127 7[C9H16N]+、162.091 3[C10H12NO]+、176.107 0[C11H14NO]+、190.159 0[C13H20N]+、191.117 9[C11H15N2O]+、205.133 5[C12H17N2O]+、206.190 3[C14H24N]+，推測其為5α-羥基萊曼堿，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖2A）。預測所得化合物5也呈現碎片離子191.1179[C11H15N2O]+、206.190 3[C14H24N]+，且與相關文獻[26-30]進行比較，推測化合物5 為苦參堿。

圖2 吡啶類生物堿類化合物質譜圖及裂解途徑Fig.2 Mass spectrogram and fragmentation pathway of pyridine alkaloid

2.1.1.2 金雀花堿類 從山豆根中共鑒定出金雀花堿類3 個，包括N-甲基金雀花堿、金雀花堿、N-己酰基金雀花堿。以化合物1 為例，在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物1 為N-甲基金雀花堿，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 205.135 3[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有162.091 3[C10H12NO]+、191.117 9[C11H15N2O]+，與相關文獻[26-29]進行比較，推測其為N-甲基金雀花堿，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖2B）。預測所得化合物2、11 均呈現碎片離子162.091 3[C10H12NO]+、191.117 9[C11H15N2O]+，推測化合物2、11 分別為金雀花堿、N-己酰基金雀花堿。

2.1.1.3 臭豆堿類 從山豆根中共鑒定出臭豆堿類1 個，為臭豆堿。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物4 為臭豆堿，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 245.166 4[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有189.102 2[C11H19N2]+，且與相關文獻[26-28]進行比較，推測其為臭豆堿，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖2C）。

2.1.2 黃酮類化合物

2.1.2.1 異黃酮類 從山豆根中共鑒定出異黃酮類化合物3 個，分別為Sophoraflavone A、7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮、Wighteone。在正離子模式下，以化合物13 為例，UNIFI 1.8 軟件預測化合物13 為7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 285.077 1[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有134.036 2[C8H6O2]+、137.023 3[C7H5O3]+、147.044 1 [C9H7O2]+、175.039 0 [C10H7O3]+、267.065 2[C16H11O4]+、270.052 3[C15H10O5]+，推測其為7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖3A）。在負離子模式下，以化合物20 為例，預測化合物20 為Wighteone，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 337.105 2[M-H]-，產生的主要碎片離子信息有269.045 5[C15H9O5]-、323.128 8[C20H19O4]-，推測其為Wighteone，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖3B）。

2.1.2.2 二氫黃酮類和二氫異黃酮類 從山豆根中共鑒定出二氫黃酮類化合物4 個，分別為苦參醇E、考薩莫A、6，8-二異戊烯基柚皮素、山豆根黃酮K，二氫異黃酮類2 個，為三葉豆紫檀苷、Sophotokin。以化合物18 為例，在負離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物18 為考薩莫A，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 525.248 2[M-H]-，產生的主要碎片離子信息有279.160 1 [C16H23O4]-、363.217 7 [C21H31O5]-、385.129 3[C21H21O7]-、399.217 7[C24H31O5]-、425.197 0[C25H29O6]-、467.171 1[C26H27O8]-，推測其為考薩莫A，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖3C）。依據UNIFI 1.8 軟件預測化合物17 為苦參醇E，化合物19 為6，8-二異戊烯基柚皮素。

2.1.2.3 黃酮醇類 從山豆根中共鑒定出黃酮醇類化合物1 個，為6，8-二異戊烯基山柰酚。化合物23在一級質譜中準分子離子峰為m/z 421.163 5[M-H]-，產生的主要碎片離子信息有311.128 9 [C19H19O4]-、350.116 0[C21H18O5]-、403.155 1[C25H23O5]-，推測其為6，8-二異戊烯基山柰酚，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖3D）。

綜上，黃酮類化合物在裂解電壓和碰撞氣體作用下，通常會發生逆-狄爾斯-阿爾德（RDA）反應，C環發生1，3 鍵斷裂或者1，4 鍵斷裂，產生1，3A、1，3B、1，4A、1，4B 碎片離子；含有異戊烯基結構的黃酮化合物通常會失去異戊烯基，而黃酮C 環的收縮會丟失CO、CO2，A 環或B 環有-OCH3的存在會丟失-CH3[31-33]。

2.1.3 其他類化合物

2.1.3.1 苯并呋喃類 從山豆根中共鑒定出苯并呋喃類2 個，為2-（2'，4'-dihydroxyphenyl）-5，6-methylenedioxybenxofuran、Shandougenine A。以化合物16 為例，在負離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物16 為Shandougenine A，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 537.082 3[M-H]-，產生的主要碎片離子信息有427.045 9[C24H11O8]-、509.087 8[C29H17O9]-，推測其為Shandougenine A，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖4A）。

圖4 其他類化合物質譜圖及裂解途徑Fig.4 Mass spectrogram and fragmentation pathway of other compounds

2.1.3.2 蒽醌類 從山豆根中共鑒定出蒽醌類1 個，為大黃素甲醚。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物12 為大黃素甲醚，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 285.077 3[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有137.0233[C7H5O3]+、253.0495[C15H9O4]+、270.0522[C15H10O5]+，推測其為大黃素甲醚，得到質譜圖及其裂解途徑（見圖4B）。

2.1.3.3 木脂素類 從山豆根中共鑒定出木脂素類1 個，為丁香脂素。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預測化合物14 為丁香脂素，在一級質譜中準分子離子峰為m/z 419.171 0[M+H]+，產生的主要碎片離子信息有205.085 9[C12H13O3]+、217.085 9[C13H13O3]+，推測其為丁香脂素。

2.2 網絡藥理學研究部分

2.2.1 山豆根化學成分靶點和疾病靶點 利用UPLC-Q-TOF/MS 結合UNIFI 1.8 軟件鑒定得到的23 種化學成分的405 個靶點與肝癌的303 個靶點取交集，構建韋恩圖（見圖5A），結果得到33 個共同靶點。

圖5 山豆根抗肝癌潛在靶點（A）、PPI 網絡（B）和山豆根“成分-靶點”網絡圖（C）Fig.5 Potential anti-hepatoma targets of Sophora tonkinensis(A)，PPI network(B)and components-targets network of Sophora tonkinensis(C)

2.2.2 PPI 網絡分析 STRING 數據庫中導入33 個潛在靶點，得到PPI 網絡關系信息，導入Cytoscape3.7.2對蛋白網絡進行可視化分析（見圖5B），度值前5 位的靶點為CCND1、AKT1、ERBB2、EGFR、ESR1，推測這些靶點可能是山豆根抗肝癌的核心靶點。

2.2.3 “成分-靶點”網絡的構建 通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建“成分-靶點”網絡圖（見圖5C）。該網絡包含55 個節點和99 條邊，其中紅色部分代表22 個山豆根化學成分（鑒定所得成分中金雀花堿潛在靶點與疾病靶點沒有共同靶點），藍色部分代表33 個共同靶點。其中 6，8-二異戊烯基山柰酚、Wighteone、大黃素甲醚、考薩莫A、三葉豆紫檀苷、Sophotokin 的度值較大，分別為11、11、10、8、8、7，因此，這些化合物可能是山豆根抗肝癌的關鍵成分。

2.2.4 富集分析 GO 功能富集分析顯示（見圖6），生物過程共獲得117 條注釋結果，主要涉及細胞因子介導的信號通路、蛋白質磷酸化、MAPK 級聯、蛋白激酶B 信號的正向調節、凋亡過程的負調控等；細胞成分共獲得15 條注釋結果，主要包括細胞質、核質、核、大分子復合物等方面；分子功能共獲得23 條注釋結果，主要涉及ATP 結合、相同蛋白結合、轉錄因子結合等方面。

圖6 GO 富集分析與KEGG 通路分析Fig.6 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

KEGG 通路富集分析共得到112 個條目，刪去不相關通路，選取前20 條富集通路，并運用微生信平臺進行可視化（見圖6）。結果顯示山豆根抗肝癌主要涉及癌癥的途徑、HIF-1 信號通路、AGERAGE 信號通路、PI3K/AKT 信號通路、ErbB 信號通路等。以上結果說明山豆根可以通過調節協調多個生物過程及多個通路發揮抗肝癌的作用。

取顯著性前20 條的KEGG 通路構建“成分-靶點-通路”網絡（見圖7），網絡共有75 個節點和362 條邊。其中紅色部分代表22 個山豆根化學成分，藍色部分代表33 個共同靶點，綠色部分代表20 條信號通路。說明山豆根抗肝癌的藥理過程涉及多成分、多靶點以及多途徑。

圖7 山豆根“成分-靶點-通路”網絡圖Fig.7 Components-targets-pathways network of Sophora tonkinensis

2.2.5 分子對接 選取成分-靶點網絡中度值前6 位的活性成分6，8-二異戊烯基山柰酚、Wighteone、大黃素甲醚、考薩莫A、三葉豆紫檀苷、Sophotokin 與PPI 網絡中 度 值排名前5 位的核心 靶點CCND1（PDBID：2W96）、AKT1（PDBID：7NH5）、ERBB2（PDBID：3PP0）、EGFR（PDBID：7AEM）、ESR1（PDBID：5FQV）進行對接，得到山豆根活性成分與靶點蛋白的最低結合能（見圖8A），通過pymol 軟件繪制分子對接（見圖8B）。結合能＜0 kcal/mol 表明配體化合物分子可以與受體靶點蛋白自發結合，結合能≤-5．0 kcal/mol表明配體化合物分子與受體靶點蛋白具有良好的結合活性。由圖8A 可知，最低結合能均小于-5．0 kcal/mol，說明靶點蛋白和山豆根活性成分具有較好的親和力。由圖8B 可知，山豆根活性成分與靶點蛋白能通過氫鍵等分子間作用力結合。

2.3 MTT 法檢測細胞活性 根據網絡藥理學分析結果以及中國藥典中山豆根的指標成分，選擇三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿和苦參堿進行細胞活性驗證。實驗結果顯示，三葉豆紫檀苷不同濃度組處理細胞的存活率較空白組明顯降低，且呈現一定的劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0．05，P＜0．01），氧化苦參堿、苦參堿不同濃度組處理細胞的存活率比空白組降低，差異有統計學意義（P＜0．05，P＜0．01）（見圖9）。結果表明三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿和苦參堿均有不同程度的抗肝癌作用。作用細胞相同時間下，三葉豆紫檀苷抑制HepG2 細胞增殖的作用大于氧化苦參堿、苦參堿，符合網絡藥理學的分析結果。

圖9 三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿對HepG2 細胞活力的影響Fig.9 Effects of Trifolirhizin，Oxymatrine，Matrine on the viability of HepG2 cells

3 討論

據報道，在中國每年新發肝癌病例和肝癌導致的死亡病例約占全球病例的50%[34]。目前主要的肝癌治療方法為手術切除腫瘤和進行肝臟移植，然而卻存在肝源缺乏、手術困難、復發概率高、預后較差等問題[35]。因此，迫切需要繼續探索和制定科學有效的抗肝癌策略。隨著不斷深入中藥在腫瘤方面的研究，發現中醫藥可以通過抑制腫瘤的生長與轉移、改善腫瘤微環境、調控細胞凋亡與自噬等不同機制發揮治療作用[36]。山豆根具有清熱解毒，消腫利咽的功效，而造成肝癌的病理機制大多是因為情志抑郁，氣機阻滯，血行不暢，導致氣滯血瘀而成；或者由于濕熱邪毒或蟲蠱、酒毒為害日久，瘀血毒結聚于肝臟所致[37]。許多研究表明山豆根具有很好的抗肝癌作用。山豆根生物堿通過調控血管內皮生長因子（VEGF）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）及磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）基因發揮明確的抗肝腫瘤作用[8]；山豆根提取物可以明顯抑制人肝癌細胞的增殖，降低線粒體的代謝活性[11]；山豆根提取物不僅能抑制人肝母細胞瘤HepG2 細胞、人肝癌Hep3B細胞的增殖，并且能使大部分HepG2 和Hep3B 細胞株產生凋亡[12]；山豆根顆粒與飲片被證實可以提高荷瘤小鼠血清中白細胞介素-2、干擾素-γ 及腫瘤壞死因子-α 等細胞因子含量，進而抑制腫瘤生長[9]；山豆根非生物堿成分也能顯著保護免疫性肝損傷[38]。但是，山豆根抗肝癌的藥效學及作用機制研究只涉及到山豆根提取物，對山豆根抗肝癌作用的藥效物質基礎及其作用靶點尚未闡明。

目前，山豆根的化學成分主要通過NMR、IR、UV、柱色譜、高效液相色譜（HPLC）、X 射線單晶衍射和圓二色譜（CD）進行鑒定，分離過程復雜且耗時[39]。而中藥的化學成分多樣，全面了解化學成分的組成有助于闡明中藥藥效物質基礎及作用機制。近年來，UPLC-Q-TOF/MS 可以對復雜組分進行高效、快速的分析，其提供了豐富的二級質譜信息，可以實現中藥化學成分的快速分離和鑒定。采用UPLC-QTOF/MS 技術鑒定山豆根化學成分可以避免復雜、繁瑣耗時的分離純化工作，提高定性分析的效率和準確性，實現對山豆根成分的鑒定，為山豆根的進一步開發利用、質量控制和藥效物質基礎研究奠定了基礎。

因此，本研究首先利用UPLC-Q-TOF/MS 結合UNIFI 軟件對山豆根成分進行了快速鑒定，共鑒定出23 個化合物。包括吡啶類生物堿9 個，異黃酮類化合物3 個，二氫黃酮類化合物4 個，二氫異黃酮類化合物2 個，黃酮醇類化合物1 個，苯并呋喃類2 個，蒽醌類1 個，木脂素類1 個。運用網絡藥理學方法進行研究，獲得了包括三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿在內的23 個有效成分，并發現其主要作用于AKT1、ERBB2、CCND1、EGFR、ESR1 等33 個核心靶點，通過調節HIF-1 信號通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K/AKT 信號通路、ErbB 信號通路等多條通路發揮抗肝癌作用。細胞活性實驗中不同濃度的三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿均能抑制HepG2 細胞的增殖，說明三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿具有不同程度的抗肝癌作用，且三葉豆紫檀苷的抗肝癌作用更顯著，與網絡藥理學結果一致，表明了山豆根的潛在活性成分具有抗肝癌作用。

研究發現，苦參堿作用于以誘導糖酵解調節磷酸酶（TP53）、血 管內皮生長因子A（VEGFA）及CCND1 等多靶點，通過體內外實驗同時驗證了苦參堿通過調節細胞凋亡、線粒體穩態等多條通路，從而起到抑制肝癌的作用[40]；苦參堿和氧化苦參堿通過抑制蛋白激酶B（AKT）磷酸化，阻滯AKT/GSK3β/β-catenin 信號通路，誘導癌細胞凋亡；或阻滯PI3K/AKT 通路，上調PTEN 表達，從而使p21、p27、p53細胞周期負性調控因子表達上調，下調細胞周期相關蛋白表達，進而抑制細胞增殖[41]。而Wighteone 能抑制EGFR 信號通路，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖[42]；三葉豆紫檀苷能夠激活EGFR-MAPK 信號通路，通過體內外實驗表明三葉豆紫檀苷可能在癌癥治療中有治療應用[43]。

此外，AKT1 作為一種蘇氨酸蛋白激酶，能夠激活PI3K/AKT 信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[44]。ERBB2 基因也稱HER2 基因，可以調節細胞生長、增殖、分化和凋亡[45]。ERBB2 基因可能激活PI3K/AKT 信號通路，抑制肝癌HepG2 細胞的生長。而PI3K/AKT 通路與各種人類惡性腫瘤生物過程有關，具有調節腫瘤細胞的葡萄糖代謝、增殖及凋亡的作用，其中 AKT 還能通過調節細胞周期來調節細胞增殖[46]。相關研究表明，CCND1 作為一種細胞周期調節蛋白，不僅能調節細胞周期蛋白依賴性激酶，而且能參與G1 期向S 期的細胞周期轉化。因此CCND1 可以調節肝癌細胞的細胞周期，促進肝癌細胞的侵襲轉移、肝癌干細胞干性維持等[47]。抑制表皮生長因子受體（EGFR）是原癌基因C-erbB-1的表達產物，EGFR 的高表達與腫瘤的發生發展密切關系[48]。ESR1 是一種類固醇受體，一旦突變，ESR1在原發性惡性腫瘤轉移中被激活，抑制ESR1 基因活化可用于抗癌；而在人類肝癌樣本中 ESR1 mRNA表達上調，下調ESR1 mRNA 表達對肝癌具有治療作用[49]。HIF 作為轉錄因子，不僅可以通過轉錄激活VEGF、下調ENT 中的E-鈣黏蛋白進而影響腫瘤細胞[50]，而且HIF 是抑制病毒性肝炎的重要治療靶點，也可以被乙肝病毒（HBV）激活，是發生肝癌的主要原因之一。

綜上所述，本研究在對山豆根化學成分鑒定分析的基礎上，利用網絡藥理學方法對山豆根23 種化學成分的33 個潛在抗肝癌靶點進行了分析，發現山豆根可能通過HIF-1 信號通路、PI3K/AKT 信號通路等多條通路抑制肝癌細胞的增殖、促進肝癌細胞的凋亡來發揮抗肝癌作用，通過分子對接技術以及細胞活性實驗進行了進一步驗證，為進一步明確山豆根抗肝癌的作用機制及臨床應用提供了理論依據和研究方向。本研究存在一定的局限性，由于流動相洗脫程序中有機相比例較高，響應較好的峰大多為極性較低的成分，如脂肪酸等，因此未能鑒定出這部分峰代表的化合物。此外，通過細胞實驗對預測的活性成分進行了初步驗證，后續研究中將進一步驗證網絡藥理學推測的作用靶點，明確活性成分與關鍵靶點的關系，從而為山豆根抗肝癌的基礎研究和臨床應用提供更加充分、完善的思路。