牛成纖維細胞體外分離培養方法

李欣淼，張子敬，張格陽，張志浩，閔 佳，王香南，朱進華，施巧婷，祁興山，祁興磊，張志鵬，徐美芳，高留濤，李若璽，黃永震，王二耀*

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西西安 712100；2.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州 450002；3.河南農業大學動物科技學院，河南鄭州 450002；4.河南省動物檢疫總站，河南鄭州 450008；5.泌陽縣夏南牛科技開發有限公司，河南泌陽 463700）；6.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 451454）

結締組織最主要的細胞成分為成纖維細胞（Fibroblasts，Fbs），對于分泌細胞外基質成分、構建細胞外基質及組織創傷修復發揮了十分重要的作用，也被稱為纖維母細胞[1,2]。典型的Fbs 形狀為細長狀或梭形，當細胞貼壁后主要呈現為梭形，細胞之間松散排列，細胞形態隨培養基和培養密度的改變而有所改變[3]。作為最易培養的細胞之一，Fbs 的增殖能力很強，生長速度快[4]。動物的Fbs 來源廣泛，包括皮膚、腺體和睪丸組織等[5-10]。近年來，隨著Fbs 體外分離培養技術的不斷完善，Fbs 在人[11]、豬[12]、綿羊[13]、牛[14]和犬[15]等不同動物上均在體外成功分離培養[16]。由于Fbs體積大、數量多，增殖分裂能力強，易獲取，在關于疾病研究的相關模型的建立、功能研究、胚胎等多個方面被廣泛應用[1,2,10,17-20]。

目前，在資源保護、轉基因技術以及動物模型等方面體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術被廣泛應用，被認為是良種快速擴繁的最直接的手段之一[2]。通過體細胞核移植技術獲得的重組胚能完整地繼承親本性狀，相對于體外受精技術來說，實驗周期短，將體細胞的細胞核注入去核卵母細胞中獲得重構胚，并通過胚胎移植技術將重構胚胎移植到受體母畜的子宮，經發育可獲得與供體動物遺傳信息一致的克隆子代[21]。到目前為止，SCNT 的相關技術已較為成熟，在品種資源保護及醫學方面都獲得了很好的成果[2,22]。目前已有研究表明，移植能否成功的關鍵取決于供體細胞的質量，供體細胞的最佳選擇之一為成年牛的耳緣Fbs[2,23]，因此，移植前期的工作重點是如何分離培養Fbs。在培養過程中，由于原代細胞不斷地進行復制和分裂，細胞不可避免地會發生衰老，不能在細胞培養過程中實現無限培養和使用。因此，需要不斷地進行技術比較和更新，從而快速獲得細胞，延長細胞的使用壽命[24-26]。本試驗通過組織貼壁法培養細胞以及組織貼壁+雙酶消化法（胰蛋白酶+膠原酶Ⅱ）分離細胞，比較兩種培養方法的目的是在短時間可以分離出成纖維細胞，且分離出的細胞存活率高，狀態良好，同時也為提高牛體細胞核移植效率提供前期試驗依據。

1 材料

1.1 試驗動物

試驗動物選自鼎元種牛育種有限公司，取10頭生產性能好的成年種公牛的耳緣組織。

1.2 主要試劑

胎牛血清（FBS）、DMEM 培養基均購自Gibco。0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、DPBS、PBS、雙抗（青鏈霉素混合物，PS）均購自索萊寶。

完全培養基為DMEM+15%FBS+2%PS，細胞消化液（DMEM+025%胰蛋白酶+2%雙抗；DMEM+025%胰蛋白酶+膠原酶Ⅱ），由河南省農業科學院畜牧獸醫研究所養牛實驗室配制。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱（Thermo），熒光倒置顯微鏡（Nikon），離心機（湘儀），搖床（旻泉，MQL-61R）。

2 方法

2.1 耳緣組織獲取及處理細胞培養

固定好牛后用肥皂水打濕耳朵，清洗，用刮刀逆向將耳朵正反的毛發刮去，越干凈越好。用75%的酒精棉球對耳神經和血管較少的部位消毒3 遍。用缺耳鉗剪下大小約為1～2cm3的組織塊（每剪下一只需要用75%的酒精對耳缺鉗進行消毒），碘伏止血。將取下的組織先在75%的酒精中清洗兩遍，再在含有1%PS 的DPBS 中清洗2遍。將清洗好的組織塊放在含1%PS 的DPBS 中低溫（4℃）帶回實驗室。在含有1%PS 的DPBS中清洗組織塊，并將剩余毛發、表皮皮膚和脆骨去除。

2.2 牛耳成纖維細胞分離培養

2.2.1 組織塊貼壁培養法

在含有1%PS 的DPBS 中將處理好的組織剪成合適大小（1～2mm3）的碎塊。將血清均勻涂于培養皿底部（35mm，1mL），將處理好的組織轉移到培養皿（60mm）中，于37℃、5% CO2培養箱中干涸培養5～8h。干涸培養后小心緩慢的加入1mL 完全培養基。24h 后補加2mL 完全培養基，2～3d 更換一次完全培養基。

2.2.2 雙酶消化法

將處理好的組織塊剪碎（0.5～1mm3），將剪碎的組織轉移至15mL 離心管中，1000r/min 離心1min 后棄上清。加入DMEM、1%PS 以及0.25%胰蛋白酶，置于37℃、5%CO2培養箱中，每5min 振搖一次，共20min。振搖后1000r/min 離心5min，棄上清。加入0.25%胰蛋白酶和膠原蛋白酶Ⅱ（3 ∶1），封口膜封口，在37℃搖床210r/min 進行消化直至出現白色透明絮狀物（約1h 時會出現白色透明絮狀物）。將絮狀物吸至含有完全培養基的培養皿（60mm）中，于37℃、5%CO2培養箱中培養[2]，2～3d 更換完全培養基一次。

2.2.3 細胞傳代及純化

棄去培養皿中的舊培養基，加入1mL PBS 潤洗，棄去PBS。加入2mL 溫好的0.25%胰蛋白酶，于37℃培養箱中消化2～3min，直至細胞由梭形變為圓形。當大部分細胞出現形態改變后，快速用移液槍吹打，直至細胞全部脫落，立即向培養皿中加入體積為胰酶2～3 倍的DMEM 進行終止[2]。用15mL 離心管收集細胞懸液，1200r/min 離心3min，只留沉淀物。使用完全培養基重懸細胞，將細胞轉移至新的培養皿中，搖勻，放在37℃、5%CO2培養箱中培養，第2 天看細胞是否貼壁；每24h 或48h 進行換液，待細胞匯合到90%左右進行傳代。傳代2～3 次即可得到純化的Fbs[2]。

3 試驗結果

3.1 組織貼壁法對細胞生長的影響

由圖1 可知，使用組織貼壁法培養時，細胞從組織中遷移出來的速度較慢，培養至第6 天時，組織塊邊緣有圓形細胞游出，培養至第10或11 天時，可觀察到長梭形細胞，Fbs 形態明顯，培養至16d 時，細胞形態密集生長，呈現渦旋狀。

圖1 不同培養時間組織塊貼壁法培養的原代牛耳成纖維細胞（100×）

3.2 組織貼壁+雙酶消化法對細胞生長的影響

由圖2 可知，相較于組織貼壁法，組織貼壁+雙酶消化時細胞遷移速度較快，第4 天即可觀察到有圓形細胞從貼壁組織邊緣遷移出來，第5 天可在組織邊緣看到梭形并伸展的Fbs（極少量），第6 天可以看到大量細胞遷移貼壁生長，培養至第10 天時可見渦旋狀生長暈。

圖2 不同培養時間組織塊貼壁+雙酶消化法培養的原代牛耳成纖維細胞（100×）

3.3 成纖維細胞傳代及純化

由圖3 可知，傳代后，細胞的生長力未受到影響，增殖能力和原代細胞相差不大。在胰蛋白酶作用后，細胞呈團狀圓形細胞貼壁。將細胞進行傳代，發現與原代細胞相比，傳代細胞形態上沒有明顯改變。當細胞貼壁后可以觀察到細胞的胞質飽滿。

4 討論

Fbs 生長速度快，且取材方便、快捷、易培養，目前有許多生物技術的直接材料都來源于Fbs，并且采集后對動物并不會產生較大影響[1,2,28]。通過Fbs 的培養，進行體細胞核移植是保護稀有、瀕危、優良品種和大型物種遺傳物質的有效措施[27]。作為核移植（NT）相關實驗的主要供體細胞，在良種保護和快速擴繁上能直接影響最終的移植效果[2,29,30]。目前組織貼壁法和酶消化法為細胞原代體外分離培養的主要方法[2,31,32]。組織貼壁法操作簡單、操作時所用時間短，但是在培養過程中組織容易貼壁不牢且細胞遷移速度慢耗時長[33]；組織貼壁+雙酶培養法操作時間長、成本較高，但在培養過程中細胞遷移速度快且生長速度較組織貼壁法快。膠原酶又稱膠原蛋白水解酶（Collagenase），它能在適宜pH 和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構[34]，而不損傷其他蛋白質和組織，對細胞的損傷較小，但長時間消化后細胞也仍不能完全脫離盤底[6]。胰蛋白酶消化細胞的能力強，但對細胞的損傷較大[5]，兩種酶混合后，胰蛋白酶的濃度會有所降低，對細胞損傷也會減小，能在較短的時間里獲得大量的細胞[2]。本試驗選取鼎元種牛育種有限公司的10頭優質種公牛的耳組織，通過比較2 種培養Fbs的方法以期高效地得到成纖維細胞。通過Fbs 的培養和獲取后續進行成纖維體細胞核移植，能將生產性能良好的種公牛資源進行保存。試驗結果表明，使用組織貼壁+雙酶培養能縮短細胞遷移和培養時間，且所獲得的細胞在傳代后生長狀態依舊良好。

5 結論

本試驗使用組織塊對2 種消化方法進行比較，最終結果表明使用組織貼壁+雙酶消化能夠縮短細胞遷移時間和培養時間，傳代后細胞貼壁較好，活力未受到較大影響，能正常生長。該方法是一種快速有效獲得牛耳成纖維細胞的方法，能夠作為在體細胞核移植技術中提供供體細胞的有效方法。