浙東白鵝種鵝多殺性巴氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗

賈惠言，周 瀟，戴久麗，王 力，陳淑芳

（寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315040）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是引起鵝巴氏桿菌病的主要病原體，該菌在自然界和畜禽體內都有存在，其抵抗力較弱，在日光曝曬下能夠死亡，在無菌的生理鹽水以及蒸餾水中也會快速死亡，主要通過接觸性傳染的方式侵害雞、鴨、鵝等禽類[1-4]。鵝巴氏桿菌病一年四季均可發生，病鵝常常發生劇烈的腹瀉癥狀，所以又稱霍亂，通常主要侵害成年禽類，以性成熟后的禽類最為易感。如果沒有及時采取有效防治，病死率可高達70%～95%，該病一旦暴發，易導致鵝群大批死亡、生產性能低下，給養鵝業造成較大的經濟損失，是危害現代養鵝業的疾病之一[5-7]。

鵝可通過外源性感染和自體感染發病[8]。外源性感染主要是由采食污染的飲水或者飼料引起，或者由消化道和呼吸道感染，也可以通過吸血昆蟲和損傷的皮膚、黏膜等多種途徑感染[8,9]。一般來說，健康鵝往往是通過外源性感染引起發病。另外，大部分動物體內都存在巴氏桿菌，是一種常見的條件性致病菌，主要在扁桃體和上呼吸道內分布，由于具有較弱的毒力，當機體健康狀況良好時不會出現發病，但在抵抗力下降時，該菌開始大量繁殖，且毒力明顯增強，并侵入血液或者淋巴，從而導致自體感染[4]。病例主要表現為突然發病，出現敗血癥病狀，下痢，死亡率高，剖解特征：全身黏膜、漿膜小點出血，出血性腸炎及肝臟壞死[10]。目前關于巴氏桿菌病的報道主要集中在牛、羊、兔等畜類和雞鴨等家禽，而鵝的報道主要集中在其他種類的肉鵝，尚無關于浙東白鵝種鵝的報道。

2023 年3 月浙江省某浙東白鵝種鵝場的種鵝突然發病，死亡2 只。病鵝體溫明顯升高，臨床表現為精神萎靡，頸部彎曲，雙眼無神，羽毛雜亂，雙翅無力；食欲較差，不采食，但會喝水；鼻竇腫大，口鼻中均流黏液，張口呼吸；排白色或綠色稀便，糞便有腥臭，偶爾發現糞便混有血液，發病后期會有持續性出血性下痢；體型偏瘦，伴有跛行和關節腫脹。剖檢主要病理變化為病死鵝的皮下與腹膜充血嚴重，并伴有小點狀出血；心包和胸膜粘連，心包膜有出血點，心包積液明顯，并滲出黃色液體，滲出液中帶有纖維蛋白塊；肝臟呈棕色，略腫大，肝臟表面發現出血點和壞死灶；肌胃出血明顯，大腸和小腸黏膜充血；脾臟柔軟，伴有腫大；肺臟明顯充血，伴有出血，呈暗紅色。因此，本試驗對浙東白鵝種鵝樣本進行致病菌的分離與鑒定，并通過藥敏試驗對該病的用藥治療提供參考，以期為種鵝巴氏桿菌病的綜合防治提供參考。

1 試驗器材與方法

1.1 試驗材料

浙江省某浙東白鵝種鵝場患病種鵝1 只、死亡種鵝2 只。

1.2 培養基及試劑

血瓊脂培養基（購自青島海博生物技術有限公司）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（購自青島海博生物技術有限公司）、麥康凱培養基（購自青島海博生物技術有限公司）、SS 瓊脂培養基（購自青島海博生物技術有限公司）、革蘭氏染色液、DNA marker DL2000（購自北京全式金生物技術股份有限公司）、2×TransTaq-T PCR Supermix（購自北京全式金生物技術股份有限公司）、瓊脂糖（購自北京全式金生物技術股份有限公司）、E-Test 藥敏試紙條（購自法國梅里埃）。

圖1 分離菌株在不同培養基上的生長情況及菌落形態

1.3 試驗儀器

手術剪和手術刀等解剖器械、接種環和培養皿等細菌培養耗材、注射器、BCE3202-1CCN 電子分析天平（北京賽多利斯制造）、IBAO 型電熱鼓風干燥箱（施都凱儀器設備有限公司）、SQ810C 型自動高壓滅菌鍋（雅馬拓科技貿易有限公司制造）、生化培養箱（施都凱儀器設備有限公司）、燒瓶、5810 型臺式高速離心機（eppendorf）、SW-CJ-IF 型超凈工作臺（蘇州安泰技術公司制造）、NE910 正置顯微鏡（寧波永新光學有限公司）、S1000 型梯度PCR 儀（BIO-RAD生命醫學有限公司）、SubcellGT 核酸電泳儀（BIO-RAD 生命醫學有限公司）、ChemDocMP 凝膠成像儀（BIO-RAD 生命醫學有限公司）。

2 試驗方法

2.1 取樣

病死鵝用消毒水表面消毒后，將鵝腹部朝上置于手術臺，首先稍微清理一下腹部羽毛，而后提起下腹部表皮用手術剪剪開一個小口，沿剪開的小口撕開腹部表皮。觀察并記錄皮下與肌肉的出血情況；剪開胸腹腔，觀察并記錄臟器病變情況；向上剪開頸部表皮，觀察并記錄頸部的皮下出血情況、食管與氣管的出血情況；向下剪開消化道，觀察并記錄肌胃、腺胃、腸道組織的病變情況和內容物滲出情況。對病死鵝或患病鵝的內臟組織和眶下竇進行無菌采樣。

2.2 細菌分離與鑒定

2.2.1 培養基的制備

血瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、麥康凱培養基和SS 瓊脂培養基按照說明書用超純水進行配制。配好的培養基121℃滅菌30min，晾涼后倒入平板，4℃冰箱內倒置保存。

2.2.2 分離培養與生化鑒定

在無菌條件下，將肝、脾、眶下竇等病料分別接種于血瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、麥康凱培養基和SS 瓊脂培養基，置于37℃恒溫培養箱培養24h。觀察菌落生長狀況與形態。無菌挑選分離純化后的單個優勢菌落，對被檢病料作觸片或涂片，片子在環境中自然干燥后用酒精燈火焰進行固定，固定后進行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌落的顏色和形態。根據微量生化發酵管說明書分別接種葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、蕈糖、山梨醇、衛矛醇、肌醇、甘露醇、硫化氫、尿素酶、賴氨酸和鳥氨酸等生化管[11]。

2.2.3 單菌落鑒定

對菌株進行16SrDNA 的擴增測序及序列分析。以分離到的純菌落作為模板，進行菌落PCR。該PCR 的反應體系為50μL：模板2μL、dNTP4μL、上游引物與下游引物各0.5μL、Taq酶0.5μL、10XBuffer5μL 以及ddH2O37.5μL。PCR反應條件：預變性5min（95℃），變性1min（95℃），退火1min（55℃），延伸2min（72℃），35 個循環；終延伸8min（72℃）。在PCR 產物中取5μL，在1%瓊脂糖凝膠中電泳；剩余的PCR產物送測序公司進行測序，將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST 同源性比對分析。

2.3 藥敏試驗

2.3.1 配制菌液

以下操作均在超凈工作臺上進行，無菌條件下用無菌的接種環挑取多殺性巴氏桿菌純菌落2個，2 個菌落加入滅菌PBS 后，用漩渦混勻器充分混合，制成多殺性巴氏桿菌菌懸液。

2.3.2 藥敏試紙條的放置

用無菌棉簽沾取菌懸液，涂布于血瓊脂平板，用無菌鑷將E-test 試紙條放置其上，置于37℃恒溫培養箱培養24h，記錄各E-test 試紙條讀數。參照抗微生物藥物敏感性試驗執行標準進行結果判定。

3 試驗結果分析

3.1 病原菌分離培養、菌落形態特征及生化試驗結果

對病死鵝肝、脾及眶下竇進行無菌采樣，分別接種于血瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、麥康凱培養基和SS 瓊脂培養基，37℃生化培養箱培養24h。在血瓊脂上形成灰白色露珠樣小菌落（圖1a），在TSA 培養基上形成透明的露珠樣小菌落（圖1b），在麥康凱培養基（圖1c）和SS 培養基（圖1d）上不生長。生化試驗結果顯示該菌株可發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、蕈糖和山梨醇；不發酵乳糖、菊糖、麥芽糖、衛矛醇、肌醇和甘露醇；硫化氫、尿素酶、賴氨酸和鳥氨酸反應陰性。

3.2 革蘭氏染色結果

從AST 平板挑單菌落進行涂片，片子固定后進行革蘭氏染色，如圖2 所示，顯微鏡觀察結果顯示革蘭氏染色為陰性，鏡下可見橢圓形短小桿菌，該菌兩極染色深、兩端為鈍圓。

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結果（1000x）

3.3 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴增結果

根據細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取分離菌DNA，PCR 擴增其16S rDNA 基因，引物由上海博亞生物技術有限公司合成，引物序列見表1。PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得1500bp 條帶，與預期結果相符（圖3）。

表1 細菌16S rDNA 基因通用引物

圖3 分離菌株16S rDNA PCR 擴增結果

3.4 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴增片段測序及序列分析

將分離到的純菌落送至浙江尚亞生物技術有限公司進行菌落測序，返回測序結果后，在NCBI 數據庫中與已有的多殺性巴氏桿菌序列進行BLAST 同源性比對。如表2 所示，分離菌株與多殺性巴氏桿菌同源性高達99.93%，判定該分離株為多殺性巴氏桿菌。

表2 細菌16S rDNA 基因通用引物

3.5 藥敏試驗

選取慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、復方新諾明、頭孢曲松、環丙沙星、粘菌素這9 種抗生素，根據說明書用E-test法對分離菌株進行最小抑菌濃度檢測。參照抗微生物藥物敏感性試驗執行標準（CLSI）進行結果判定[12]，如表3 所示，慶大霉素的最小抑菌濃度為1μg/mL，2023 版CLSI 中對慶大霉素敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于2μg/mL，該菌對慶大霉素敏感；美羅培南的最小抑菌濃度小于0.008μg/mL，CLSI 中對美羅培南敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于1μg/mL，該菌對美羅培南敏感；氨芐西林的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對氨芐西林敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于8μg/mL，該菌對氨芐西林敏感；阿莫西林的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對阿莫西林敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于8μg/mL，該菌對阿莫西林敏感；紅霉素的最小抑菌濃度為8μg/mL，CLSI 中對紅霉素敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于0.5μg/mL，對紅霉素耐藥的最小抑菌濃度折點為大于等于8μg/mL，中介范圍為1～4μg/mL，因此該菌對紅霉素耐藥；復方新諾明的最小抑菌濃度小于0.064μg/mL，CLSI中對復方新諾明敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于2/38μg/mL，該菌對復方新諾明敏感；頭孢曲松的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對頭孢曲松敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于1μg/mL，該菌對頭孢曲松敏感；環丙沙星的最小抑菌濃度小于0.032μg/mL，CLSI 中對環丙沙星敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于0.25μg/mL，該菌對環丙沙星敏感；粘菌素的最小抑菌濃度小于0.5μg/mL，CLSI 中對粘菌素敏感的最小抑菌濃度折點為小于等于1μg/mL，該菌對粘菌素敏感。

表3 分離菌株藥敏試驗結果

4 討論

巴氏桿菌病的發生流行與氣候變化、飼養管理、營養狀況、興奮、損傷以及潛伏性疾病等有關[4]。暴發季節主要在夏季、秋季和冬季，該病在發病禽舍舍飼時很難完全清除，可以在同一場地連續發生。雖然目前已有多殺性巴氏桿菌疫苗，對降低禽霍亂造成的損失有一些保護作用，但多殺性巴氏桿菌存在血清型多、交叉免疫力差和保護期短等問題，導致疫苗的免疫效果不理想，使該病在鴨群中仍時有發生[13,14]。近年來隨著鵝產業的不斷發展，鵝巴氏桿菌病的診治和藥敏報道不斷增加[15,16]。

2023 年3 月在浙江省象山縣種鵝場獲得患鼻竇炎的種鵝病料，為確證感染鼻竇炎的細菌種類，本研究從發病浙東白鵝的種鵝無菌采集肝、脾及眶下竇，分離并純化到1 株細菌，通過在4種培養基上觀察培養特性、革蘭氏染色性質、顯微鏡下形態學觀察、生化鑒定試驗等方法，發現該菌株與多殺性巴氏桿菌的特性基本一致，初步認為純化到的菌株為多殺性巴氏桿菌。隨著分子生物學的發展，細菌的分離鑒定早已有很多報道使用PCR 方法作為鑒定的輔助方法，可以從序列上更加準確地確定病原[3]。目前，已有文獻報道利用多殺性巴氏桿菌中的標志基因建立鑒定多殺性巴氏桿菌的PCR 方法[17]。為進一步驗證該結果，用16S rDNA PCR 的方法來確證，用巴氏桿菌的序列設計引物后進行PCR 擴增，得到一個1500bp 的條帶，與預想的一致。將該單菌落進行測序，測序結果與NCBI 數據庫中多殺性巴氏桿菌已有的序列進行BLAST 比對，同源性達99.93%，從DNA 序列的層面證實了分離到的菌株為多殺性巴氏桿菌。

大量監測結果表明，畜牧業中抗菌藥物仍存在使用不當的情況，這種不當的使用非常容易使細菌對抗菌藥物產生耐藥性。細菌產生耐藥性后，容易形成找藥困難或無藥可醫的局面，從而造成該細菌快速傳播，對畜牧業發展產生負面影響。因此，不可濫用抗生素，需根據藥敏的結果，選擇敏感藥物按常規劑量和療程對畜禽進行治療。本研究對分離到的菌株進行了藥物敏感試驗，結果表明，分離菌株對慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、復方新諾明、頭孢曲松、環丙沙星、粘菌素8 種抗生素均敏感，對紅霉素耐藥。

針對本次在浙東白鵝種鵝場發現巴氏桿菌引起的生病與病死情況，除去采樣的試驗病死鵝（試驗病死鵝采樣后也進行無害化處理），病死鵝立即采取無害化處理，病鵝采取隔離飼養，同時對運動場地、飼養圈舍、飼養用具以及被污染的場地進行全面消毒滅源，每天2 次，疫情得到控制后每周進行1 次消毒[18]；病鵝及時根據藥敏試驗結果將藥物與水混合均勻后任其飲水；健康鵝群每只翅下注射2mL 禽霍亂組織滅活苗，應注重健康鵝的生活環境，盡量保證鵝舍的通風，保持鵝舍的干燥，糞便應及時處理，定期抽血檢查，爭取發現早、治療早，避免造成巨大損失。

畜禽產業疫病重在防控，多殺性巴氏桿菌易感染成年鵝，種鵝要做好防范措施，后備種鵝應在70 日齡接種鵝巴氏桿菌滅活苗，經產種鵝應在每年7 月份開產前接種鵝巴氏桿菌滅活苗。需要注意疫苗的保存溫度和保質期，并且在開封后盡快使用。

5 結論

此次在浙江省某浙東白鵝種鵝場患病鵝與病死鵝體內分離到單一致病菌，該菌在形態學和生化反應等方面均符合多殺性巴氏桿菌的特征，菌落PCR 的結果顯示該致病菌16S rDNA 序列與多殺性巴氏桿菌的DNA 序列同源性高達99.93%，進一步確證了本次分離到的致病菌為多殺性巴氏桿菌。此次分離到的致病菌對慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、復方新諾明、頭孢曲松、環丙沙星、粘菌素等8 種敏感，可為單獨用藥或聯合用藥治療提供參考，但該菌對紅霉素耐藥，應避免使用。