5個惡唑烷酮類新化合物對銅綠假單胞菌群體感應系統的抑制研究

湯倩玲?溫福龍?袁陽?吳怡?馬文博?褚以文?趙克雷

摘要：目的 以銅綠假單胞菌PAO1為模式菌，研究惡唑烷酮類新化合物對銅綠假單胞菌群體感應系統的抑制作用及其作用機制。 方法 測定5個惡唑烷酮類新化合物對PAO1生物膜、綠膿菌素、運動能力抑制活性，采用qRT-PCR測試其對群體感應相關基因的下調作用，并評估化合物對秀麗隱桿線蟲感染模型的保護活性。結果 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對PAO1生物膜、綠膿菌素、運動能力具有較強的抑制活性，其作用機制均是并顯著下調PAO1中10個已知的受群體感應系統正調控的基因。化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對秀麗隱桿線蟲感染模型具有良好的體內保護活性，其中化合物SIIA-MA2對急性感染模型具有顯著保護活性；化合物SIIA-MA4對慢性感染模型具有顯著保護活性。結論 惡唑烷酮類新化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4通過抑制PAO1群體感應系統發揮抗感染作用。

關鍵詞：惡唑烷酮類化合物；銅綠假單胞菌；群體感應；群體感應抑制劑

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Study on inhibition of quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa by five novel oxazolidinones

Tang Qianling， Wen Fulong， Yuan Yang， Wu Yi， Ma Wenbo， Chu Yiwen， and Zhao Kelei

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To evaluate the inhibitory activities of novel oxazolidinone compounds on the quorum sensing （QS） system of P. aeruginosa reference strain PAO1. Methods The influences of five novel oxazolidinones on the QS system， biofilm formation， pyocyanin formation， and motility ability of P. aeruginosa PAO1 were tested， followed by checking the expression of 10 typical genes that are positively regulated by the QS system of P. aeruginosa using qRT-PCR. Caenorhabditis elegans-P. aeruginosa PAO1 infection model was employed to explore the in vivo protective effect of compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4.? Results Compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 significantly inhibited the production of biofilm， pyocyanin， and bacterial motility of P. aeruginosa PAO1， and the expression levels of QS-controlled genes were significantly down-regulated. Furthermore， the treatment of compound SIIA-MA2 significantly protected C. elegans from the fast-killing of P. aeruginosa PAO1， while the compound SIIA-MA4 mainly functioned in the slow-killing assay. Conclusion This study reveals anti-QS activities of the new oxazolidinone compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 against P. aeruginosa， and provides a method for the discovery of novel anti-infectious drugs.

Key words Oxazolidinones; Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing; Quorum sensing inhibitor

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一種條件致病菌，容易導致局部感染和全身感染，患有免疫功能受損疾病（如囊性纖維化、癌癥和艾滋病）的患者更易感染。PA通過毒力因子產生致病性，其固有耐藥與生物膜相關[1]。PA的生物膜形成和多數胞外毒力因子的合成和分泌都受群體感應系統（quorum sensing， QS）調控，QS在PA的致病性和耐藥性中起著重要作用[2]。PA具有las、rhl與pqs等3個QS調控系統，且las系統能夠正向調控其余兩個系統，QS抑制劑的開發對防控PA的感染與耐藥性具有重要意義[3]。

本研究前期通過分子對接技術對自建化合物庫中的化合物進行虛擬篩選，得到了22個惡唑烷酮類新化合物，利用M9-腺苷培養基與LB培養基進行差異性培養篩選[4]，在50 μmol/L的化合物濃度下經初篩得到5種活性化合物（圖1），再設置25、50、100、200 μmol/L的濃度梯度開展量效關系研究，最終確定了50 μmol/L為最適抑制濃度。本文報道5個化合物對PA生物膜、綠膿菌素及運動能力的抑制作用，以及活性化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對QS相關基因表達的下調作用和對秀麗隱桿線蟲感染模型的保護活性。

1 材料

1.1 供試化合物

按照文獻方法[5]合成純度大于95%的化合物，配成濃度為10 mg/mL二甲亞砜（DMSO）溶液，經肉湯稀釋法[6]測定5種化合物對PAO1的最小抑菌濃度均大于1024 μg/mL，均為無直接殺菌作用的化合物。

1.2 菌株及線蟲

野生型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）由本實驗室保存，嘧啶缺陷型大腸埃希菌OP50（Escherichia coli OP50）及野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）N2由加拿大戴爾豪斯大學Balakrishnan Prithiviraj博士惠贈。

1.3 培養基

秀麗隱桿線蟲感染試驗采用快殺培養基（peptone-glucose-sorbitol agar media，PGS）和慢殺培養基（slow killing agar media，SK）[7]。

1.4 試劑

DMSO、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、七水硫酸鎂、腺苷乙醇、三氯甲烷為分析純，購于成都市科隆化學品有限公司；結晶紫染料購于Solarbio公司；細菌RNA提取試劑盒購于福際生物有限公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒，購于Takara Bio公司。

1.5 儀器

LDZM-80KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺，浙江孚夏醫療科技有限公司；CMax Plus酶標儀，Molecular Devices公司；UV5500PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；CFX96熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；SMZ168體式顯微鏡，杭州歐爾柏維科技有限公司。

2 方法

2.1 化合物生物膜抑制活性檢測

參照Hwang等[8]的方法，利用結晶紫染色法檢測5個化合物對PAO1生物膜產量的抑制作用。初篩活性化合物的終濃度設置為50 μmol/L，設置DMSO為空白對照。

2.2 化合物綠膿菌素抑制活性檢測

參照Chakraborty等[9]的方法，將5個化合物的終濃度設置為50 μmol/L，設置DMSO為空白對照。

2.3 化合物運動能力抑制活性檢測

參照Ghosh等[10]的方法，利用瓊脂濃度為0.5%的LB固體培養基研究5個化合物在50 μmol/L濃度下對PAO1游動能力的抑制活性，利用瓊脂濃度為1%的LB固體培養基研究化合物在50 μmol/L濃度下對PAO1震動能力的抑制活性，以mm為單位測量菌落在培養基上形成的菌落直徑大小。設置DMSO處理組為空白對照組。

2.4 化合物SIIA-MA4、SIIA-MA2對QS相關基因表達量的影響

按照細菌總RNA提取試劑盒的操作方法提取對照組與SIIA-MA2、SIIA-MA4處理組PAO1總RNA。將上述PAO1總RNA反轉錄為cDNA，采用Zhao等[11-12]設計的QS正調基因特異引物，使用SYBR Green qPCR試劑盒與CFX96熒光定量PCR儀定量分析SIIA-MA2與SIIA-MA4對相關調控基因以及功能基因表達量的影響。以PAO1的16S rRNA作為內參基因，通過2-??Ct計算方法將每個目標基因的相對表達量標準化。

2.5 化合物SIIA-MA4和SIIA-MA2對PAO1感染秀麗隱桿線蟲的保護活性

參照Tan等[7]的方法，分別挑取10只處于L4期的秀麗隱桿線蟲于PGS培養基與SK培養基上，分別于20 ℃恒溫培養箱培養80和11 d，觀察記錄線蟲存活情況，設置給藥組和DMSO對照組。

2.6 統計方法

實驗數據均為3次生物學重復的平均值±標準誤差，使用GraphPad Prism 8進行ANOVA檢驗，使用log-rank （Mantel-Cox） test對線蟲生長曲線進行生存曲線差異度比較；以P<0.05時判定具有顯著性差異，P < 0.01時判定具有極顯著性差異。

3 結果

3.1 化合物抑制PAO1生物膜和綠膿菌素的生成

與DMSO對照組相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3與SIIA-MA5在50 μmol/L時對PAO1生物膜和綠膿菌素無顯著抑制作用（P>0.05）。而50 μmol/L濃度的化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4處理過的PAO1生物膜產量均顯著減少（圖2a），化合物SIIA-MA2對PAO1生物膜產量有極顯著的抑制作用（P<0.01）；化合物SIIA-MA4對PAO1生物膜的產量有顯著性抑制作用（P<0.05）。化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L終濃度的條件下，對PAO1綠膿菌素產量均有極顯著的抑制作用（圖2b）。

3.2 化合物抑制PAO1運動能力

在瓊脂濃度為0.5%的LB固體培養基中，與DMSO對照組相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3與SIIA-MA5在50 μmol/L時對PAO1運動能力無顯著抑制作用，但化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4對PAO1的游動能力顯示出極顯著抑制作用（P<0.0001）（圖3 a）。在瓊脂濃度為1%的LB固體培養基中（圖4b），與DMSO對照組相比，化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L的終濃度下，對PAO1的震顫能力顯示出極顯著抑制作用（P<0.01）。

3.3 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4抑制QS相關毒力基因的表達

與DMSO對照組相比，化合物SIIA-MA2作用下的PAO1群體感應系統調控基因lasR、rhlR、pqsR和下游功能基因lasB、rhlA、pqsA、pqsE、pqsD、hcnA和phzA1的表達水平均呈現不同程度的下調，其中調控基因lasR具有極顯著差異（P<0.001）。化合物SIIA-MA4作用下的QS調控基因表達水平也均有不同程度的下調，其中調控基因lasR的下調具有極顯著差異（P<0.01），同時，rhlR與pqsR兩個調控基因下調均有極顯著差異（P<0.001）。表明化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4通過同時抑制3個QS系統產生對PA的抑菌活性。

3.4 化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4對PAO1感染秀麗隱桿線蟲的保護活性

結果表明，化合物SIIA-MA2對急性感染PA的秀麗隱桿線蟲有顯著保護作用，化合SIIA-MA4對慢性感染PA的秀麗隱桿線蟲有顯著保護作用。

在急性感染模型中（圖5a和圖5c），DMSO對照組中的線蟲在20 h開始死亡，在40 h時死亡率達到50%；在80 h時線蟲已完全死亡，而化合物SIIA-MA2給藥組的線蟲在40 h時開始死亡，在80 h時仍有50%的存活率，有顯著性差異（圖5a）；化合物SIIA-MA4給藥組的線蟲在40 h時開始死亡，在80 h時，有25%的存活率，但無顯著性差異（圖5c）。

在慢性感染模型中（圖5b和圖5d），DMSO對照組的線蟲在第10天時死亡率達到100%，而化合物SIIA-MA2處理過的線蟲整體死亡速率更慢，但無顯著性差異（圖5b）。DMSO對照中的線蟲在第9天時全部死亡，而化合物SIIA-MA4給藥組在第9天的時候線蟲存活率為40%，具有顯著性差異（圖5d）。

4 討論

惡唑烷酮類抗菌藥物是繼喹諾酮類和磺胺類后研發的第三類化學全合成抗菌藥物，對常見耐藥革蘭陽性菌如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有治療效果。第一個惡唑烷酮類藥物是利奈唑胺，于2000年4月在美國上市，對革蘭陽性菌有良好的抑菌作用，暫無抑制PA群體感應方面的研究。輝瑞公司用二氫噻嗪類替代C環合成了一系列衍生物，將惡唑烷酮類化合物原有的抗菌譜擴大到革蘭陰性菌[13]。曾善超等[14]和Jiang等[15]以3-氨基-2-惡唑烷酮為骨架設計合成了一系列衍生物，得到化合物XYL-13與Z2，化合物XYL-13在576 μmol/L的濃度下有效抑制PA生物膜、綠膿菌素產量，抑制PA的運動能力；利用紫色色桿菌CV026在125 μmol/L時篩選出化合物Z2有QS抑制作用。

本研究在前期采用分子對接技術預測惡唑烷酮類化合物與LasR的結合位點過程中，發現利奈唑胺結構中的惡唑烷酮雜環和苯環基團是重要結合位點。因此以惡唑烷酮雜環和苯環為基本骨架合成了22個新結構衍生物，經抗QS活性初篩獲得了本文報道的5個目標化合物，結合5個化合物的體外抗QS表型試驗結果和化學結構，推測化合物苯環上的甲氧基基團是該類化合物抑制QS活性所必需的，而結構中苯環上的鹵素基團不利于抑制活性的保持。化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4，能在50 μmol/L的低濃度下較顯著的抑制PA的QS系統及相關毒力因子。在秀麗隱桿線蟲感染保護實驗中，化合物SIIA-MA2與SIIA-MA4在PA的急性感染和慢性感染中表現出了不同的保護活性，化合物SIIA-MA2對線蟲的急性感染模型有顯著保護活性，化合物SIIA-MA4對線蟲的慢性感染模型有顯著保護活性，可能與化合物SIIA-MA2的苯環上比化合物SIIA-MA4多一個甲基有關，有研究表明藥物分子中引入甲基能夠增加分子對靶蛋白的親和力[16]，兩個化合物體內活性的差異需要更深入的構效關系研究加以闡明。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-11-14

基金項目：四川省科技廳杰出青年科技基金項目（No. 2021JDJQ0042）；成都大學高層次人才培育項目（No. 2081920066）

作者簡介：湯倩玲，女，生于1997年，在讀碩士研究生，研究方向為先導化合物開發，E-mail： tql875@sina.com

*通信作者，E-mail： zhaokelei@cdu.edu.cn