中醫證候小型豬模型的研究進展?

張麗萍,李 丹,劉 春,吳曉筱,段俊國

(1.成都中醫藥大學,成都 610075;2.成都中醫大銀海眼科醫院,成都 610084;3.中醫藥眼病防治與視功能保護四川省重點實驗室,成都 610075)

小型豬在解剖、生理、生化等方面與人類極為相似,因此被視為理想的動物模型,廣泛應用于醫學領域。在中醫藥現代化的進程中,小型豬模型逐漸應用于不同中醫學科,如中醫理論[1]、中醫診斷[2]、中藥方劑[3]、針灸推拿[4]等,并不斷取得新的研究成果。中醫證候是疾病發生和演變過程中某階段以及個體當時所處特定內外環境本質的反映,疾病的病因和病理共同構成了證候的本質,證候主要體現疾病某一階段的病理狀態。中醫重視“辨證論治”,證候動物模型的研制對疾病的病因、發病機制的探索及中醫藥的作用機制、物質基礎和新藥研發等方面均具有重要的意義。本文將對不同中醫證候小型豬模型的研究進展進行綜述,以期能為相關研究提供思路。

1 血瘀類證候模型

中醫證候小型豬模型最早始于冠心病病證結合模型,研究者通過手術干預的方式建立冠心病血瘀證小型豬模型。

王偉團隊采用在小型豬左冠脈前降支放置Ameroid縮窄環的方法,建立冠心病心肌缺血血瘀證小型豬模型[5]。該研究通過在小型豬左冠脈前降支第一間隔支起始部遠端放置Ameroid縮窄環,使之緩慢膨脹壓迫冠脈,影響血行,最終造成慢性心肌缺血血瘀證候。并于術后動態觀察模型動物行為改變及一般行為、舌象、血液流變學等指標,發現術后4～8周為血瘀證時間窗[6]。以活血化瘀之丹七片對該模型進行干預,結果顯示其對心肌缺血及血瘀證的部分表現具有改善作用,可視為模型制備成功的反證[7]。同時對該證型進行了相關蛋白組學[7]和代謝組學[8-10]等方面的研究。之后該團隊在前期基礎上再次展開實驗,延長指標觀測時間,于術后8～12周對模型動物進行證候評價,并在血瘀證指標基礎上加入小型豬搖尾次數以評價其精神狀態和活動度,作為氣虛的評價指標,辨證這段時期為氣虛血瘀證時間窗[11],基于一般狀態、舌色、活動度、血液流變學、心電圖、冠脈造影、超聲心動圖等指標對該模型進行證候評價,制定小型豬觀察量表,并結合不同時期的研究結果,發現該模型由血瘀到氣虛血瘀的證候演變規律與“血為氣之母”“因瘀致虛”等中醫理論相呼應,一定程度上促進了中醫理論的現代化,并為之后的相關研究提供了模型基礎。其后,該團隊再次建立冠心病心功能不全血瘀證小型豬模型,并基于該模型從轉錄組學和代謝組學對益氣通脈、活血止痛之芪參顆粒治療冠心病心功能不全氣虛血瘀證可能存在的有效藥物靶點和效應機制通路、藥理機制進行了探討[12]。楊愛國[13]則采用開胸結扎冠脈前降支的方法制備“胸痹”“心痛”心脈瘀阻證小型豬模型。該造模方法通過手術損傷心脈,使血行受阻而致血瘀;且直接結扎血管致血運受阻,致瘀阻心脈,最終形成胸痹心脈瘀阻證。術后正常飼養15 d,通過體征、血液流變學、心電圖、心肌細胞超微結構、核轉錄因子 (nuclear transcription factor,NF)-κB和細胞間黏附分子(intercellular adhension molecule,ICAM)-1等指標判定造模成功。在模型建立后對冠心病的治療要穴內關穴予以針刺干預作為反證,并基于各觀測指標對內關穴治療胸痹的機理進行了探討。

除了病證結合血瘀證模型,單純的血瘀證候模型在病因造模和病理造模方面也都取得了一定的研究成果。病因造模方面,馮麟等[14]采用失血聯合冰冷刺激的方法進行造模,失血以致血虛血瘀、冰冷刺激以致寒凝血瘀,從而建立血虛寒凝血瘀證小型豬模型。造模前后基于體征、血常規、血液流變學、凝血、腸系膜微循環、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血栓素(thromboxane,TX)B2、6-酮-前列環素(6-keto prostaglandin,6-Keto-PG)F1α等指標進行觀察和辨證。模型建立后,以溫經散寒、養血通脈之當歸四逆湯進行干預,結果顯示模型動物的癥狀、體征和病理變化均有改善,反證模型制備成功。病理造模方面,趙麗峰[15]采用靜脈注射10%高分子右旋糖酐溶液的方法,成功復制血瘀證小型豬模型。高分子右旋糖酐進入血液,被紅細胞吸附,在紅細胞之間起橋梁作用,產生紅細胞聚集[16],從而導致組織血流灌注明顯減少,引起嚴重的組織缺氧,很快出現微循環障礙,可一定程度模擬血瘀狀態,研究者通過造模前后血液流變學、凝血、血常規、血糖、血脂、D-2聚體等指標對模型進行評價。

2 痰證類證候模型

楊關林團隊對脾虛痰濁證候進行了長期且深入的研究,并選擇小型豬作為實驗動物建立病理模型,基于該模型對脾虛痰濁證候展開了較為充分的探索,不僅完成了模型的制備,還逐步完善了模型評價、病證結合等方面的研究。通過高熱量喂飼結合跑步過勞的方法,成功建立脾虛痰濁證候小型豬模型[17]。以高熱量喂飼模擬中醫飲食不節病因,以跑步過勞模擬中醫勞倦過度病因。通過觀測體溫、體尺值、糞便黏度、等待喂食行為、皮毛、口色、抗疲勞能力等指標對模型進行評價。并隨后建立了小型豬脾虛痰濁證候評價量表,但因脈象采集困難而未將其納入[18]。其后,該團隊進一步采用不同的造模方法,嘗試建立不同的病證結合模型,如采用高熱高脂喂飼、跑步過勞、球囊拉傷冠脈聯合的方法,成功建立了冠脈粥樣硬化脾虛痰濁證模型[19],采用跑步運動聯合高脂單籠喂飼的方法,成功建立了高脂血癥脾虛痰濁證模型[20],采用隔日游泳、高脂飼料、冠脈結扎法聯合的方法,成功建立了冠心病脾虛生痰證模型[21]。在模型建立相對完備后,基于各模型分別從不同角度進行了現代化的探索?；谄⑻撎禎嶙C候小型豬模型對神經內分泌免疫網絡相關指標進行了觀察,并對病理機制進行了探討[22]。基于冠脈粥樣硬化脾虛痰濁證小型豬模型,從線粒體能量代謝[23]、膽固醇代謝[24]、水通道蛋白(aquaporins,AQPs)[25-26]、腦組織β淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)[27-28]等對健脾祛痰化瘀法的作用和機制進行了研究與探討;從線粒體能量代謝方面[29]、肝臟脂質代謝和AQP3、AQP4、磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)等方面對健脾化瘀祛痰方的作用和機制進行研究和探討[30];從小腸蛋白組學、小腸和肝臟線粒體能量代謝角度對健脾祛痰化瘀方藥進行療效評價和機制探討[31-32];從線粒體能量代謝角度對益氣健脾化痰祛瘀方進行藥效評價和機制探討[33-34]?；诠谛牟∑⑻撎禎嵝⌒拓i模型,對“從脾論治”法進行療效評價[35]?；诟咧Y脾虛痰濁小型豬模型,對健脾祛痰法的作用機制進行了研究[36]。

該團隊在不斷完善小型豬模型制備的過程中,創新開發了許多小型豬專用的專利產品,如小型豬跑步機[37]、小型豬臀寬測量卡尺[38]、糞便黏度測定裝置[39]、小型豬轉移籠[40],為小型豬實驗提供了新的指標與方法。

3 痰瘀互結證候模型

痰瘀互結證小型豬模型當前僅見于冠心病病證結合模型。劉建勛團隊采用高脂飼料喂飼結合冠脈球囊拉傷的方法進行造模,造模過程中,對模型動物的體質量指數(body mass index,BMI)、血脂、高敏C-反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、體表心電圖、冠脈造影、病理學指標等進行監測和辨證,成功建立了冠心病痰瘀互結證小型豬模型[41]。該團隊在完成模型建立后,進一步制定小型豬痰瘀互結證冠心病中醫證候診斷及評分標準[42],隨后基于前期研究結果再次展開實驗,進一步規范化采集舌象,從色度學進行分析,并探討了脈搏圖在該動物模型中的應用,研究者認為脈搏圖可以一定程度反映疾病的發展規律,但復合因素造模的動物疾病模型其應用可能受限,而無創血流動力學指標進行的脈象標準量化評分則可準確穩定地反映疾病特點[43]。并從內皮組織損傷、冠脈血管斑塊穩定性到蛋白組學、細胞死亡模式等層面研究冠心病疾病模型的病理機制,揭示痰瘀互結證候的演化過程[44]。在之后的實驗中,結合血脂代謝、炎癥反應、血液流變學等相關指標變化規律,探索冠心病痰瘀互結證“痰、毒、瘀”病機演變的客觀規律,推動冠心病中醫病因病機學發展[45]。基于該模型從中醫證候評分[46]、心功能[47]、血脂和血液流變學[48]等角度對活血化瘀、祛痰行氣之痰瘀同治方進行藥效評價。基于該模型進行了方證相應研究,選取行氣通陽、祛痰散結之瓜蔞薤白半夏湯作為化痰方,活血祛瘀、行氣止痛之血府逐瘀湯作為祛瘀方,瓜蔞薤白半夏湯合血府逐瘀湯作為痰瘀同治方,結果顯示痰瘀同治可以更好地體現方證相應的治療原則而取得最佳療效[44];對比了益氣復脈、養陰生津之生脈膠囊和寬胸通陽、化痰散結、活血化瘀之丹蔞片的療效,結果顯示,比之方證不相應的生脈膠囊,與痰瘀互結證方證相應的丹蔞片療效更佳[49]。

潘永明等[50]通過高脂飼料喂養、靜脈注射維生素D3(vitamin D3,VD3)和異丙腎上腺素(isoproterenol,Iso)的方法,成功建立慢性心肌缺血痰瘀互結證小型豬模型。通過高脂飼料喂養聯合VD3損傷內皮細胞,破壞血管內皮的完整性;通過注射Iso增加心率和心肌收縮力,使心肌耗氧量增加,導致心臟超負荷和心肌微循環障礙、冠脈痙攣和心肌梗死或心肌細胞肥大、壞死,從而共同參與推進慢性心肌缺血的病程。監測指標為體質量、心電圖、血脂、心肌酶、血液流變學、炎癥、心臟指數和心肌缺血面積等,其中,研究者認為脂質代謝、血液流變學、心肌酶代謝和炎癥等指標可作為痰瘀互結證的客觀生化物質基礎,這些變化可反映中醫“痰瘀互結、瘀毒致變”的病理發展進程。

張慧等[51]通過高脂飼料喂飼的方法建立高脂血癥痰濕證小型豬模型,模型判定指標為體質量、體尺、腹圍、血脂和主要中醫證候體征變化,并以利水滲濕、溫陽化氣之經方五苓散進行干預,結果顯示痰濕程度有所減輕,可視為模型成功的反證。

4 氣陰兩虛證候模型

氣陰兩虛小型豬模型當前主要為劉建勛團隊所建立,該團隊為探討有益氣養陰、通脈止痛作用之通脈養心丸的療效,選取小型豬為模型動物,采用介入技術球囊封堵冠脈左前降支30 min后撤出行再灌注損傷的方法,建立冠心病氣陰兩虛證模型[3]。研究者認為心肌缺血再灌注損傷后心功能不全所引起的體循環灌注不足的病理狀態可對應氣陰兩虛證;而心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞喪失導致心功能下降,一定程度是心氣虛的體現;在機體體循環長期有效灌注不足的狀態下,引起血管內和組織間隙液體循環失調,二者作為關鍵病理環節共同參與了氣虛不化津、氣陰兩虛的病理過程。該研究于術前和術后4周分別檢測了無創血流動力學、舌象、脈象等指標。術后4周對模型動物施以生脈膠囊和通脈養心丸,二者皆為冠心病氣陰兩虛證的對證方劑,結果顯示二者均可不同程度改善冠心病氣陰兩虛證小型豬舌象和脈象,保護心肌組織,恢復心臟血流動力學的異常狀態,可視為模型制備成功的反證。

5 陽虛類證候模型

王郭琦等[52]采用含有1%腺嘌呤和1%地塞米松飼料喂飼的方法,成功制備腎陽虛小型豬模型。腺嘌呤終代謝產物尿酸可刺激腎組織,引起炎癥反應,造成連續病變,最終導致腎功能損害[53];地塞米松等激素主要通過給予外源性糖皮質激素,導致垂體前葉的促腎上腺皮質激素釋放受到抑制,導致腎上腺皮質分泌類固醇激素減少,從而表現為腎陽虛的癥狀[54]。證候判定指標為宏觀表征,體溫,血清睪酮、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine 3,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine 4,FT4)、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、總三碘甲狀腺原氨酸(total triiodothyronine,TT3)、總甲狀腺素(totalthyroxine,TT4)、尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)等。相波[55]則選擇肌肉注射氫化可的松琥珀酸鈉的方法復制虛寒證候小型豬模型,觀測指標主要為小型豬證候觀測表、生命體征、免疫學指標、甲狀腺指標、物質能量代謝指標等。

6 實熱證候模型

肖建強[56]通過腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)懸液的方法,成功復制實熱證小型豬模型。模型評價指標主要有一般體征、TT3、TT4、補體3(complement3,C3)、C4、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G、IgM、血糖、血細胞壓積(hematocrit,HCT)、白細胞計數(white blood cell,WBC)、紅細胞計數(red blood cell,RBC)、血小板計數(platelet count,PLT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)等。LPS屬于中醫學“毒”的重要組成部分之一[57],LPS侵入機體的過程,可視為熱毒侵犯機體的過程,結合相關指標發現攻毒后不同時相的病理改變與溫病病機病程的進展極為相似[58],LPS進入機體后,引發系統性免疫應答釋放多種炎癥細胞因子,炎癥細胞因子過量會引起機體發熱、血管通透性增加、中性粒細胞增多等炎癥病理反應,因而,LPS常用于實熱證、熱毒血瘀證及溫病衛氣營血證模型的制備。

7 結語

對現有的中醫證候小型豬模型相關研究進行整理后發現,中醫證候繁復多變,當前雖已完成了部分證候模型的制備,但還有許多亟待完善,尚不足以滿足臨床和科研的需求。小型豬的病證結合模型當前多見冠心病病證結合模型,其原因在于小型豬的心臟解剖結構及側支循環與人類相似,且豬的凝血因子和纖溶活性與人的相近程度高于其他動物。除此之外,小型豬作為理想的動物模型與人類相似之處還有很多,如免疫系統、腎臟、皮膚、眼球、鼻軟骨等,尚待科研工作者的深入挖掘。

中醫藥現代化進程在某種程度上也是一個不斷量化的過程。就中醫證候小型豬模型的制備而論,當前工作主要集中在四診信息的標準化采集和量化、證候量表的制定等方面。小型豬中醫證候造模當首重四診信息的采集?？偨Y相關文獻如下:一般情況包括精神狀態及活動度、色澤(鼻唇、被毛)、飲食二便、體溫(常為肛溫、耳溫、鼻溫);舌象的采集和分析方面,通常使用相機結合比色卡以固定距離和固定光源垂直拍攝舌面,再基于專業軟件,如Adobe photoshop等進行分析;脈象存在不同采集方式,可基于血流動力學參數進行脈象判定,亦可基于脈象儀進行脈象信息采集和分析?？梢?四診信息采集處在未統一標準的階段,現階段研究者獲取的小型豬的四診信息主要基于望診(包含舌診)和脈診得來,未來小型豬四診信息逐漸規范化、量化將會更有助于相關科研工作的推進。

在實驗過程中,可依據具體實驗情況適當延長實驗周期,把握合適或規律的時間節點采集和觀察相應指標,從而對病理過程進行更加全局和動態的觀察,以獲得對模型更加宏觀的把控,對證候的發生發展與轉變才會有更加確切的體察。

完成造模后,在模型成功的基礎上,當進一步完善證候量表的制定,這有利于該模型的推廣應用,便于同行交流、應用和不斷完善,最終形成學界公認的證候判定標準,進而推動中醫藥現代化進程。