厚冰凍切片尼氏染色方法研究

金一丹,沈俊媛,解子璇,潘永良,劉婉茹

(湖州師范學院 醫學院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

腦區劃分的精準程度會影響細胞和神經化學物質在不同腦區的分布統計結果,進而影響腦科學整體實驗結論[1].尼氏染色法使用堿性染料(焦油紫、甲粉紫、硫堇等)使神經元胞體內的尼氏小體著色[2],染色后,腦區邊界清晰,組織結構明顯,因此常被用于薄組織切片的二維形態學分析[3],是實現腦區劃分的重要方法.相較薄切片而言,百微米級的厚腦切片包含的細胞更多,且神經元的形態更完整[4],因此更適于一些神經化學物質的分析和細胞整體形態學結構的觀察.雖然已有研究詳細介紹了幾微米到五十微米厚度薄切片的尼氏染色方法[5-6],但缺乏對更厚切片尼氏染色方法的相關報道,由此導致在對厚切片區域劃分時,研究者需參照連續薄切片的染色圖像,對解剖結構和相對位置進行人工重建.然而,這種方法易存在主觀差異和產生形態學干擾[7-8],極大影響了實驗結果的準確性.因此本實驗以長爪沙鼠200 μm冰凍腦切片為研究對象,在薄切片尼氏染色方法的基礎上,對厚冰凍切片染色過程中可能出現冰晶樣空洞、脫片、染色不均等問題的步驟加以改良,以探討出一套適用于厚冰凍切片的尼氏染色方法.

1 材 料

1.1 實驗動物

雄性長爪沙鼠購自浙江省實驗動物中心,實驗期間飼養于溫度(22±2)℃、相對濕度(50±5)%的環境中.本研究對實驗動物的所有操作均遵循湖州師范學院實驗動物使用規范,并在處理過程中盡量減少動物的痛苦.

1.2 實驗器材與試劑

防脫載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)、Leica CM1850 冰凍切片機(德國雷卡公司)、染色架(FJ026,上海碧云天生物技術有限公司)、LZJ-6EL型手術顯微鏡(鎮江中天光學儀器有限責任公司)、Zeiss Axio Scope.A1顯微鏡(北京盛鴻程科技有限公司)、立式缸等;4%多聚甲醛(41533,國藥集團化學試劑有限公司)、TritonX-100(14600102,西隴化工股份有限公司)、PBS溶液(C0221A,上海碧云天生物技術有限公司)、尼氏(Nissl)染色液(C0117,上海碧云天生物技術有限公司)、酒精、蒸餾水等.

2 研究方法

2.1 厚切片制備

長爪沙鼠按8 mg/100 g的標準經腹腔注射戊巴比妥鈉溶液進行麻醉后立即斷頭取腦,將腦組織置于干冰中速凍至表面變白后存于-80 ℃冰箱中,以待備用.冰凍切片機溫度控制在-10～-12 ℃,切片前將鼠腦移至冰凍切片機內復溫至少20 min.行200 μm冠狀面切片,取置于室溫下的防脫載玻片與處于冰凍切片機操作環境溫度(-10～-12℃)下的腦區冠狀切片,其溫差近35 ℃,這可使切片自然黏附于防脫載玻片上.

2.2 染色步驟

切片經40～50 ℃烘干2～3 h,再經室溫完全風干后,放入4%多聚甲醛溶液中固定,置于4 ℃冰箱過夜;從4%多聚甲醛固定液中取出,放入鋁制染色架內,通過立式缸內蒸餾水浸泡玻片1 min的洗滌方法,洗去多聚甲醛;將切片置于含0.5% TritonX-100的PBS溶液中破膜2 h,再在立式缸內用蒸餾水浸泡玻片1 min,洗去破膜液;室溫下焦油紫染色30 min,將切片浸入蒸餾水2次,再依次浸入濃度分別為 50%、75%、85%、95%、100%的酒精中進行梯度脫水,每種溶液的脫水時間均為1 min,共7 min.以上操作皆于立式缸內完成.中性樹膠封片、貼標簽,晾干后及時在顯微鏡下觀察,并拍攝成像.

3 結 果

采用Zeiss Axio Scope.A1顯微鏡,在50倍和200倍下觀察長爪沙鼠厚冰凍腦切片,結果見圖1.由圖1可見,尼氏小體著色明顯,呈深藍色;背景著色均勻,呈淡藍色;無冰晶空洞,染色對比度強(圖1).

手術顯微鏡所成的切片圖像見圖2.由圖2可見,腦區界限清晰,皮層、海馬、腦室等組織結構明顯,切片形態基本完整,無松散、皺褶、脫片現象.

4 討 論

在神經科學領域,用百微米級的厚切片開展特定腦區神經元形態學觀察和基因表達分布等研究,越來越受到人們的重視.雖然尼氏染色在幾微米至數十微米厚度的薄切片染色中較為成熟,但在厚切片中報道較少.以往研究發現,厚切片染色易出現空洞、脫片、染色效果不佳等問題.因此,本研究在薄切片尼氏染色方法的基礎上,對厚切片染色過程中出現問題的步驟進行改良,以建立一套適用于厚切片尼氏染色的方法.

在腦組織冷凍切片染色中,切片最好稍晾干后再固定,而不能立即固定[9-10].因為腦組織內有多個微囊,冰凍切片立即固定染色會出現類似冰晶的空洞,而用電熱吹風正吹后或室溫晾干后固定染色則無空洞形成[11-12].馮家成等用電熱吹風正吹切片或將切片置于室溫晾干2 min以上后固定,可使微囊消失彌合,且無空洞產生[13].因馮家成等處理的是4～6 μm冰凍切片,所以本研究根據切片厚度及烘干溫度,調整了烘片時間的長短,染色效果理想.實驗證明,烘片時間與切片厚度成正比,與烘片溫度成反比.但要注意的是:溫度不可過高,否則會破壞細胞的形態結構[14];烘片時間也不宜過長,在切片較為透明時即可停止烘片,否則會出現染色過程中的“灰染”現象.

固定和染色的時間長短常影響切片的染色效果.本方法將200 μm切片置于4%多聚甲醛溶液中固定超12 h,切片固定充分,染色均勻,細胞著色清晰.梁艷清等認為,4%多聚甲醛較溫和,可維持細胞形態,適合作為新鮮組織冰凍切片的固定液[15].但其固定速度慢,通常需要較長的固定時間[16],而且厚切片的中間組織不易徹底固定,染色后中間細胞著色模糊,染色不均[17].延長固定時間可使核漿著色后的光學差異更為顯著,顏色更加鮮明,便于觀察[18].這與本研究的染色結果一致.本文采用焦油紫染液染色30 min左右,染色結果清晰、對比度強.探索染色時間時,在尼氏染色第一遍蒸餾水洗滌后,直接在鏡下觀察切片的染色程度.若染色較淺、核質清晰度一般,可復染并適當延長染色時間;若染色過深、核漿顯色對比度弱,可適當延長不同梯度酒精的分色時間.

防脫片在染色過程中十分重要,實驗操作一般要做到以下幾點:①固定前充分烘片,使切片與載玻片貼合得更緊密,以降低脫片的概率;②使用染色架要以立式缸浸泡玻片的洗滌方法取代流水直接沖洗,以有效減少因劇烈洗滌而導致的脫片;③尼氏染色切片需經梯度脫水和二甲苯透明.但厚切片經二甲苯透明后,易發脆變硬,進而出現破碎、松散、脫片.因此,本文未采用二甲苯透明,而是用酒精脫水后直接封片,在保證切片質量的同時,還可避免與有毒試劑接觸,且更為安全.

本研究改良了厚切片尼氏染色過程中易產生的冰晶樣空洞、脫片、染色效果不佳等問題,獲得了良好的染色效果,能較為清晰地展現出厚切片的組織形態,進一步提高了尼氏染色技術在厚切片中的應用價值.這種適用于厚切片尼氏染色的方法也可為多種厚度、多種組織切片類型的尼氏染色提供參考.