BRD4 通過靶向GSTP1 調控食管癌TE-1細胞順鉑敏感性

張獻棣 陳明軍

作者單位：212000 江蘇大學京江學院檢驗科

食管癌是常見惡性腫瘤類型, 全球每年新發約60 萬例, 因其死亡人數超54 萬例, 其中我國約占50%［1］。由于早期癥狀不明顯, 缺少漿膜易侵犯和轉移, 治療后復發率較高, 食管癌患者5 年總體生存率為25%～47%［2,3］。目前在新輔助以及中晚期食管癌患者綜合治療方案中化療無疑發揮著關鍵作用, 因此提高化療效果以及識別早期復發的危險因素將對最終改善患者預后有重要的意義。溴結構域蛋白4(bromodomain containing 4, BRD4)是識別蛋白賴氨酸乙?；瘹埢年P鍵結構蛋白, 可廣泛調節表觀遺傳修飾和基因轉錄的眾多分子進程, 近來被認為是淋巴瘤、肝癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤的潛在治療靶標, 但其在食管癌發生、發展過程中的作用研究較少［4-7］。本研究中首次聚焦于BRD4 對食管癌化療敏感能力的影響, 基于生物信息學數據分析BRD4 在食管癌中的表達水平及其與化療藥物關鍵解毒酶GSTP1 之間的聯系, 結合靶向處理探究BRD4 在食管癌細胞順鉑敏感性調控中作的作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及培養條件 TE-1 購自于上海中喬新舟生物科技, 并附有短串聯重復序列鑒定檢驗報告；TE-1 細胞培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)1640 基礎培養基, 添加終濃度為1%青霉素和鏈霉素(雙抗), 置恒溫培養箱37℃、5% CO2條件下培養和傳代。

1.1.2 主要耗材和試劑 細胞及轉染專用Opti MEM 培 養 基、雙 抗( 美 國Gibco 公 司)；FBS( 以 色列Biological Industries 公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、細胞高效RIPA 裂解液、Western blot 實驗相關試劑(北京索萊寶公司)；蛋白酶抑制劑Cocktails(美國ApexBio 公司)；高敏型ECL 化學發光檢測曝光液、180 kDa 蛋白Marker(南京諾唯贊公司)；順鉑(Cisplatin, DDP)、(+)-JQ1 粉劑(上海Selleck 公司)；一抗稀釋液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2 關聯X 蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、谷 胱 甘 肽 硫 基 轉 移 酶P1(Glutathione S-transferase P, GSTP1) 和 鼠 抗 人GAPDH抗體(武漢三鷹公司)；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 切割體(cleaved-caspase-3)抗體(美國CST 公司)；兔抗人BRD4 抗體(美國abcam 公司)；HRP 偶聯的抗鼠和抗兔二抗(南京川博公司)； LipofectamineTM2000 轉染試劑(美國ThermoFisher 公司)；siRNA-BRD4(5'-GGAGA UGACAUAGUCUUAATT-3')、siRNA-GSTP1(5'-ACACC GTGGTCTATTTCCCAGTTCG-3')以及陰性對照(上海生工生物工程有限公司)；增強型CCK-8(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學驗證 利用TCGA 數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov) 獲 取TCGA-ESCA 項 目STAR 流程的RNAseq 數據并提取TPM 格式的數據, 樣本中共174 例腫瘤組織, 11 例癌旁正常組織, 采用R (4.2.1)版本, R 包：ggplot2［3.3.6］, stats［4.2.1］, car；根據數據格式特征選擇獨立樣本t 檢驗進行統計并進行數據可視化, 配對樣本采用配對樣本t 檢驗：提取對應編號配對的癌旁和癌樣本(共計8 對), 數據處理方法：log2(value+1)；利用GEPIA2 在線分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析BRD4 與GSTP1 分子表達相關性：設置相關系數為Pearson。

1.2.2 siRNA 及藥物處理 將TE-1 細胞接種于6 孔板中, 待細胞覆蓋率達50%左右更換為不含雙抗培養基, 將細胞分為3 組：陰性對照組(Negative control, 轉染無序序列)、干擾BRD4 組(轉染siRNA-BRD4)；干擾GSTP1 組(轉染siRNA-GSTP1)進行處理, 取適量LipofectamineTM2000 和各siRNA 溶液混合于Opti MEM培養基中轉染處理細胞6 h, 去除轉染試劑繼續培養24 h 進行后續實驗；待6 孔板TE-1 細胞數目至70%～80%左右, 去除培養基PBS 清洗后分別加入稀釋后含不同濃度(+)-JQ1 (25、50 和100 nM), 對照組加入等體積DMSO；(+)-JQ1 預處理對DDP 殺傷影響：采取(+)-JQ1(50 nM) 處理24 h 后加入DDP (5 μg/ml, 最高濃度液由無菌水現配現用)或等體積無菌水繼續處理24 h 進行后續實驗；以上實驗均重復3 次或設置3 個以上復孔。

1.2.3 Western blot 檢測TE-1 細胞中凋亡相關蛋白經不同實驗處理后TE-1 細胞總蛋白用含有PMSF 和蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解提取, 經12%或15%濃度SDS-PAGE 膠電泳后轉PVDF 膜于含0.5%脫脂奶粉TBST 液中室溫封閉1 h, 凋亡相關抗體根據說明書推薦稀釋后4℃孵育PVDF 膜過夜, TBST 洗膜后孵育對應二抗(稀釋比為1∶8000)室溫孵育1 h 后繼續洗凈即可采用ECL 化學發光自顯, 利用軟件將目的條帶灰度數值化, 并與GAPDH 的灰度值作歸一化處理后計算各蛋白表達差異。

1.2.4 CCK-8 實 驗 檢 測(+)-JQ1 預 處 理 對TE-1 細胞DDP 敏感性的影響 將3×103個TE-1 細胞接種于96 孔 板 每 孔 中, 隨 機 分 為2 組：(+)-JQ1 處 理 組(50 nM)以及對照組(等體積DMSO 溶液), 設置5 個復孔分別繼續培養, 24 h 后將DDP 按濃度梯度(3.125、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/ml)加入處理24 h, 并于處理結束后每孔加10 μl 的CCK-8 溶液, 避光振蕩孵育0.5～1.0 h 后在酶標儀上分別檢測450、650 nm 波長下每孔吸光度值, 650 nm 作為參考波長進行雙波長測定, 分 組 間 使 用R 包：ggplot2［3.3.6］, drc［3.0-1］分別計算細胞活性(百分數), 擬合模型(log-logistic法)計算DDP 的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值［8］。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 如果數據符合正態分布則通過方差齊性檢驗, 兩組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA), 獨立樣本采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學數據庫分析食管癌中BRD4 表達水平 TCGA 數據解析后結果顯示, 食管癌腫瘤組織中BRD4 的mRNA 總體表達水平相較于癌旁正常組織有明顯升高［(5.61±0.57)VS(4.80±0.59)］, 差異有統計學意義(P=0.0000＜0.001)。見圖1A。進一步通過對比配對腫瘤和癌旁正常組織樣本發現, 食管癌患者食管癌組織中BRD4 表達水平(5.57±0.31)普遍顯著高于其癌旁正常組織的(4.77±0.44), 差異有統計學意義(P=0.0016＜0.01)。見圖1B。

2.2 食管癌中BRD4 與GSTP1 表達的聯系 為揭示BRD4 與食管癌化療敏感性的聯系, 本研究使用GEPIA2 數據庫發現, 在食管癌化療藥物耐藥形成過程中關鍵解毒結合酶GSTP1 與腫瘤組織中BRD4 表達呈正相關(r=0.26, P=0.00029＜0.001)。見圖2A。結合靶向siRNA 處理Western blot 結果顯示, siRNA-BRD4 處理后食管癌TE-1 細胞中BRD4 和GSTP1 的表達水平較NC 組均有明顯升高, 而siRNA-GSTP1 后TE-1 細胞中GSTP1 表達下調未對BRD4 蛋白產生明顯影響。見圖2B。進一步采取BRD4 靶向抑制劑的梯度濃度處理證實, 伴隨(+)-JQ1 濃度升高TE-1 細胞中GSTP1 蛋白的表達水平較陰性對照組出現明顯下降趨勢, 而由于(+)-JQ1 主要是通過結合于BRD4 的溴結構域發揮作用,僅在最高濃度處理(100 nM)組食管癌細胞中BRD4 出現表達抑制作用。見圖2C。

圖2 食管癌中BRD4 與GSTP1 表達之間聯系

2.3 (+)-JQ1 增強DDP 對食管癌TE-1 細胞的殺傷作用 低濃度的(+)-JQ1(50 nM)處理可引起食管癌TE-1細胞抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達下調以及凋亡相關蛋白Bax 表達上升, 但對caspase-3 并無明顯影響, 而在與DDP 聯合應用時可見caspase-3 的活化形式cleavedcaspase-3 的相比DDP 單獨使用組細胞有顯著表達上調。Western blot 結果表明, (+)-JQ1 預處理抑制BRD4的功能可以提高DDP 對食管癌細胞的殺傷作用。見圖3。

圖3 (+)-JQ1 預處理對DDP 殺傷TE-1 細胞的影響

2.4 靶向抑制BRD4 提高TE-1 細胞對DDP 的敏感性 CCK-8 結果顯示, 食管癌TE-1 細胞經抑制BRD4蛋白功能［(+)-JQ1, 50 nM, 24 h］預處理后可顯著提高對化療藥物DDP 的敏感性, DMSO 對照組DDP 的IC50值為(19.43±0.59)μg/ml, 而(+)-JQ1 預處理后降至(10.46±0.24)μg/ml, 差異有統計學意義 (P＜0.05)。以上結果表明, 食管癌細胞中BRD4 可能參與對化療藥物DDP 敏感性調控。見圖4。

圖4 (+)-JQ1 預處理對TE-1 細胞對DDP 的IC50 值影響

3 討論

BRD4 作為溴結構域和超末端結構域(bromodomain and extra-terminal domain, BET)蛋白家族中研究較為廣泛的結合蛋白之一, 主要通過其N 端兩個串聯溴結構域(bromodomains, BDs)即BD1 和BD2 與組蛋白質或非組蛋白質(主要為轉錄調控因子)上已發生乙?；揎椀馁嚢彼釟埢嘟Y合, 進而招募、活化正轉錄延伸因 子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb)到啟動子近端區域(promoter-proximal regions)磷酸化RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, PolⅡ)介導基因轉錄和延伸, 從而發揮調節胚胎發育、細胞增殖、代謝調控和免疫應答等作用［9-11］。因此, BRD4 的表達和功能失調與多種疾病有關, 包括癌癥、免疫紊亂和代謝疾病等, 尤其是在腫瘤細胞中高表達的BRD4 主要通過調控程序性細胞死亡(program cell death, PCD)進程參與眾多類型腫瘤的發生與進展［12-17］。本研究中通過整理TCGA 數據庫中食管癌相關信息解析后發現, 食管癌組織中BRD4 的mRNA 表達整體水平明顯高于癌旁正常組織；配對樣本數據也顯示, 與正常組織相比同一患者的腫瘤樣本中BRD4 出現明顯上調。目前腫瘤研究表明, 對于肝癌、胃癌、結直腸癌、肺癌等患者而言, 高表達的BRD4 常與其不良預后存在密切聯系［4,6,7,18］。已有食管鱗癌相關數據指出, 異常高表達的BRD4 蛋白可以通過形成復合體直接結合到染色體 濃 縮 調 節 蛋 白2(chromosome concentration regulatory protein 2, RCC2)的啟動子區域, 進而上調有絲分裂所必需的分子RCC2 的表達以促進腫瘤細胞的持續增殖［19］。然而, 對于食管癌中高表達的BRD4 是否參與治療拮抗形成, 特別是化療療效是否存在影響尚缺乏相關探討和論證。

食管癌早期診斷率偏低, 多數患者初次就診時已處于中晚期, 喪失了手術干預的意義, 除此之外超過50%的早期患者會在手術后發生復發或轉移, 因此化療成為食管癌綜合治療中的重要手段之一［20,21］。其中, DDP 作為核心成分與其他藥物形成的不同組合是目前中晚期食管癌患者術后輔助化療標準方案, 但其臨床實際療效存在顯著個體差異, 且整體預后水平仍較差［22］。近年來的研究發現, 以GSTP1 為代表的一類藥物代謝酶通過催化谷胱甘肽和親脂性化合物與親電中心之間的反應, 提高親電子細胞毒物的水溶性, 促進鉑類藥物代謝, 從而影響化療療效［23,24］。本研究基于GEPIA2 數據論證發現, 食管癌組織中BRD4 與GSTP1表達之間存在顯著正相關關系。由于BRD4 在眾多類型腫瘤中表現出的基因表達調控作用, 本研究首先通過靶向siRNA 干擾處理發現, 在食管癌細胞中下調BRD4 處理后觀察到GSTP1 的表達抑制, 但siRNAGSTP1 處理對BRD4 表達無顯著影響。進一步通過梯度濃度的BRD4 靶向抑制劑處理證實, 食管癌中BRD4蛋白功能穩定是維持GSTP1 持續表達的重要分子基礎。近來研究證實, 在包括多種血液系統癌癥以及實體瘤中BRD4 可直接結合到Bcl-2 基因的啟動子和超增強子區域, 促進凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表達。后續研究中也初步證實, 低濃度的(+)-JQ1 預處理即可下調Bcl-2 蛋白的表達, 同時后者阻抑蛋白Bax 出現一定程度的上調, 而(+)-JQ1 預處理可顯著增強DDP 的殺傷作用。CCK-8 的細胞毒性實驗與上述結果相一致, 表明BRD4 在食管癌細胞DDP 敏感性調控中發揮重要作用。

本研究首次在食管癌中發現高表達BRD4 與化療敏感性關鍵酶GSTP1 表達之間存在聯系, 當然也存在部分局限性, 例如無法有效回顧性分析BRD4 表達與食管癌患者預后的聯系以及化療方案療效評估的臨床意義。然而, 本研究作為基礎研究, 初步驗證了BRD4對GSTP1 表達的調控作用, 同時論證了BRD4 靶向抑制對提高食管癌細胞DDP 敏感性的作用, 對接受以DDP 作為基礎的食管癌化療患者的預后評估具有潛在的臨床指導意義。