GPNMB 通過PI3K/Akt通路調節小膠質細胞M2極化減輕缺血性腦卒中后神經損傷的機制研究①

劉 夢 朱洋洋 方敬獻 （南陽市第一人民醫院，南陽 473010）

腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占80%，具有高致殘率與致死率［1-2］。因此迫切需要能有效減輕卒中致殘的辦法。

小膠質細胞是駐留在大腦中的免疫細胞，能分泌神經元存活所需的生長因子，并介導了CIS 后腦損傷或損傷修復。既往研究指出小膠質細胞M2極化具有神經保護作用，因此將小膠質細胞由親炎的M1表型轉換至抗炎的M2表型可能成為CIS有效的治療策略［3-6］。

糖蛋白非轉移性黑色素蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanin B， GPNMB）是一種跨膜糖蛋白，通過識別細胞外信號可在一定程度上發揮免疫抑制作用，最近GPNMB 被報道在缺血性動物模型中表達明顯增加，并表現出神經保護作用［7-9］。ONO等［10］研究指出GPNMB 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）通路發揮神經保護作用。而WANG 等［11］研究中指出PI3K/Akt 信號通路的激活具有誘導小膠質細胞M2 表型、減輕炎癥與保護神經的作用。

本研究分別使用大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型與體外缺氧缺糖（oxygen and glucose deprivation，OGD）條件培養細胞作為CIS 體內外模型，采用腺病毒相關病毒（adeno-associated virus，AAV）定點注射改變腦組織內Gpnmb表達，并通過質粒轉染與PI3K 抑制劑LY294002 干預細胞，檢測GPNMB、PI3K/Akt 通路對小膠質細胞極化與CIS 神經損傷的影響及分子間的調控關系，旨在明確CIS 后腦損傷與修復的分子機制，為CIS患者治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 12 只SPF 級SD 大鼠（雄性，8 周齡，體質量240～260 g）與3只新生SPF級SD大鼠（雄性，1 日齡，體質量18～20 g），均由河南省實驗動物中心提供［生產許可證號：SCXK（豫）2017-0001、SYXK（豫）2020-0004］。所有大鼠均可自由攝食飲水，并飼養在12 h/12 h 光/暗循環、溫度（22±3） ℃、濕度（60±5）%環境下。所有動物操作均符合動物實驗的倫理要求及3R 原則。本實驗已通過南陽市第一人民醫院倫理委員會審批（審批號：20201202036）。

1.1.2 主要試劑與儀器 TTC 染色液（#G3005）購自北京索萊寶公司；Hanks 溶液（#C0218）、RIPA 裂解液（#P0013B）、ECL 化學發光試劑（#P0018S）、LY294002（#S1737）均購自上海碧云天生物公司；鼠抗GPNMB 抗體（#MA5-24014）、鼠抗GAPDH 抗體（#MA1-16757）、鼠抗PI3K 抗體（MA1-74183）、鼠抗p-Akt抗體（MA1-20325）、鼠抗Akt抗體（#AHO1112）、HRP 標記羊抗鼠抗體（#G-21040）、鼠抗Iba1 抗體（#MA5-38265）、兔 抗CD16（#MA5-36143）、兔 抗CD206 抗體（#MA5-32498）、Alexa Fluor?488 標記羊抗兔抗體（#A-11008）、Alexa Fluor?568 標記羊抗鼠抗 體（#A-11004）、含B27 的 神 經 元 培 養 基（#A3653401）、DMEM/F12 培 養 基（#11995040）、TRIzol 試 劑（#15596026）、pcDNA3.1（-）質 粒（#V79520）、Lipofectamine?2000 轉 染 試 劑 盒（#11668030）均 購 自 美 國Thermo Fisher Scientific 公司。表達Gpnmb與shRNA-Gpnmb的AAV 載體由上海吉滿生物合成。

激光多普勒血流儀ALF2100（日本東京ADVANCE 公司）；轉棒疲勞儀Rotarod SA102（江蘇賽昂斯生物科技公司）；熒光顯微鏡DM4000 BLED（德國萊卡公司）；凝膠成像儀WD-9413B、蛋白電泳儀DYCZ-24DN（北京六一儀器廠）；細胞培養箱HGPN-270（山東歐萊博公司）；三氣培養箱SQ-80N（上海慕斯實驗設備有限公司）；熒光定量PCR 儀Applied Biosystems 7500（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 MCAO 構建 采用MCAO 作為CIS 模型［12］，大鼠術前禁食10 h，靜脈注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，體溫維持在36.5～37.5 ℃。在大鼠頸動脈內插入一條尼龍單絲縫合線，向前推進到閉合中腦動脈（middle cerebral artery，MCA）起點，使用激光多普勒血流儀通過引導管插入左側大腦皮層監測腦血流，當腦血流量降低幅度在基線水平30%以上視作建模成功，4 h后通過取出縫合線恢復腦灌注。對照組大鼠進行假手術，操作方式相同，但不使用縫合線對MCA進行阻斷。

1.2.2 大鼠分組干預 將大鼠隨機分為4組，每組3 只：對照組、MCAO 組、KD-Gpnmb組與OV-Gpnmb組，對照組與MCAO 組注射AAV 空載體，KD-Gpnmb組、OV-Gpnmb組分別注射包裹shRNA-Gpnmb、Gpnmb的AAV 載體，具體方法為［13］：將大鼠麻醉后，鉆取直徑 為5 mm 的 骨 孔，使 用 微 型 泵 將2.5 μl（8.1×1012μg/ml）相應載體定點緩慢注射至大鼠大腦皮層（相對Bregma：AP+0.02 mm，L-3.2 mm，V-1.5 mm），注射完后封閉骨孔，縫合傷口。MCAO 組、KDGpnmb組與OV-Gpnmb組均在注射1 周后構建MCAO模型，對照組進行假手術。

1.2.3 神經功能測試 建模第3 天通過改良神經功能缺損評分（modified neurological deficit score，mNSS）對大鼠神經缺損程度進行評估［14］，評估內容包括運動試驗、感覺試驗、反射喪失與不正常運動等，評分范圍為0～18 分，分數越高代表神經系統功能損害越嚴重：0 分表示沒有明顯損傷，1～6 分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。采用轉棒疲勞測試評估大鼠感覺運動協調性。將大鼠置于加速旋轉桿上，在5 min 內從4 r/min 增加到120 r/min，測試大鼠3 次，每次間歇5 min，記錄從旋轉桿上掉落延遲時間。采用膠帶去除試驗評估感覺運動功能，將大鼠置于籠中1 min，并將50 mm2膠帶粘貼在右前肢遠側橈骨區域，記錄接觸時間和去除膠帶時間。每只動物試驗3 次，每次實驗截止時間為120 s。

1.2.4 TTC 染色 建模3 d 處死大鼠，迅速取下大腦置于冰上，將大腦組織行冠狀切片，厚度1 mm，采用2%TTC 染色，Image J 軟件計算梗死區域面積，每個大鼠選取3 片大腦冠狀切片作為重復，計算平均值。

1.2.5 細胞分離培養 從新生大鼠腦組織中分離培養小膠質細胞、星形膠質細胞與神經元。先取下頭部，打開顱骨后收集腦組織，切除腦干與小腦，并去除蛛網膜組織和表面血管，將腦組織置于無血清的DMEM/F12 培養基中，加入0.125%胰蛋白酶于37 ℃消化5 min，500 g 低速離心5 min，以新鮮的DMEM/F12 培養基（含10%胎牛血清、50 U/ml 青霉素、50 mg/ml 鏈霉素、1 mmol/L 丙酮酸鈉、2 mmol/L L-谷氨酰胺與100 mmol/L非必需氨基酸）重懸細胞，將細胞接種于含新鮮培養基的培養瓶中，每2 d 更換1次培養基。采用差速貼壁法純化培養小膠質細胞和星形膠質細胞，采用添加B27 的神經元培養基培養神經元。細胞培養溫度為37 ℃，并向培養箱中持續通入含有5%CO2的潮濕空氣。采用流式細胞儀分析3種細胞純度，即小膠質細胞、星形膠質細胞與神經元分別測定CD11b、GFAP 與Hb9 抗體標記，純 度 測 得 分 別 為（99.0±0.5）%、（97.7±0.8）%與（96.6±1.0）%，符合要求。

1.2.6 OGD 干預 模擬體外缺血條件培養細胞，采用缺血培養基（Hanks 溶液中添加140 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L KCl、0.43 mmol/L KH2PO4、1.25 mmol/L MgSO4、1.7 mmol/L CaCl2、5 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L HEPES，pH調整至7.2～7.4），將其置于缺氧培養箱（95%N2、5%CO2）中培養。

1.2.7 細胞分組干預 將小膠質細胞分為4組：對照組、OGD 組、pcDNA-Gpnmb組和pcDNA-Gpnmb+LY294002 組，將pcDNA-Gpnmb重組質粒通過Lipofectamine?2000 轉染試劑盒轉染至pcDNA-Gpnmb組和pcDNA-Gpnmb+LY294002 組細胞中，對照組與OGD組細胞均需轉染pcDNA空質粒載體。轉染48 h篩選穩定表達的細胞，pcDNA-Gpnmb+LY294002 組培養基中添加1.5 μmol/L PI3K 抑制劑LY294002，繼續培養24 h 后，對照組正常培養24 h，其余3 組進行OGD干預24 h。

1.2.8 Western blot 測定蛋白含量 采用RIPA 裂解液從大鼠的缺血半暗帶大腦皮質組織和細胞中提取總蛋白，經過硫酸-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚乙烯二氟化物膜，使用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入對應抗體，將膜在4 ℃孵育過夜，取出磷酸緩沖液中浸泡，0.1%Tween 20 浸泡5 min，加入二抗后于室溫下孵育1 h，化學發光檢測蛋白相對表達量，以GAPDH作為內部參數。

1.2.9 免疫熒光測定組織/細胞極化標志物 將切除的大腦組織制成20 μm冠狀切片，細胞采用4%多聚甲醛固定于玻片，使用10%正常血清阻斷，分別添加一抗（CD16 抗體、CD206 抗體和組織需用的Iba-1 抗體，1∶100 稀釋）在4 ℃下孵育過夜，室溫下用熒光標記二抗孵育2 h，細胞需進行DAPI 復染3 min，采用熒光顯微鏡拍照，并用Image J軟件分析計算染色陽性細胞數量，每個大腦分析3個連續切片。

1.2.10 RT-PCR 檢測組織/細胞極化標志物 采用TRIzol 試劑提取總RNA，將1 μg 總RNA 反轉錄成cDNA，隨后以cDNA 作為模板進行RT-PCR 檢測，數據采用2-ΔΔCt法進行分析，以GAPDH 作為內部參數，各引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.3 統計學方法 采用Graphad PRISM8.0 進行數據的統計分析與圖形繪制，實驗數據均采用±s表示，多組間數據采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差齊性F檢驗，符合方差齊性與正態分布的數據采用獨立樣本t檢驗，不符合方差齊性與正態分布的數據采用非參數檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GPNMB 在MCAO 大 鼠 腦 組 織 與OGD 培 養細胞中的表達情況 采用Western blot 檢測GPNMB在MCAO 大鼠腦組織與OGD 培養的細胞中的表達情況。結果顯示：與正常大鼠腦組織相比，GPNMB在MCAO 建模3 d 的大鼠腦組織中表達量升高（P<0.05，圖1A）；與正常培養的小膠質細胞相比，OGD培養24 h 的小膠質細胞GPNMB 表達量升高（P<0.05，圖1B），但神經元與星形膠質細胞中GPNMB表達水平相比差異無統計學意義（P>0.05，圖1B），且小膠質細胞中GPNMB 表達量隨著OGD 培養時間推移而升高，在恢復正常氧培養24 h 后，GPNMB 表達量又下降至正常水平（P>0.05，圖1C）。提示GPNMB 在CIS 模型中表達上調，且主要來源于小膠質細胞。

圖1 GPNMB 在MCAO 大鼠腦組織與OGD 培養細胞中的表達情況Fig.1 Expression of GPNMB in MCAO rat brain tissue and OGD cultured cells

2.2 GPNMB 對大鼠腦卒中后神經功能與腦梗死程度的影響 為探究GPNMB 在大鼠CIS 中的作用，采用AAV 載體注射的辦法分別將大鼠腦組織內的Gpnmb抑制或過表達（圖2A），比較大鼠腦卒中后神經功能與大腦組織梗死程度。結果顯示，抑制Gpnmb后 構 建MCAO，大 鼠mNSS 評 分 升 高（P<0.05，圖2B），Rotarod 測試中延遲掉落的時間縮短（P<0.05，圖2C），膠帶去除試驗中接觸時間與去除時間均延長（P<0.05，圖2D），TTC 染色觀察到腦梗死區域增大（P<0.05，圖2E），而過表達Gpnmb則得到相反的結果（P<0.05）。以上結果表明GPNMB 可以減輕CIS梗死程度與神經功能損傷程度。

圖2 GPNMB對大鼠腦卒中后神經功能與腦梗死程度的影響Fig.2 Effect of GPNMB on neurological function and degree of cerebral infarction after stroke in rats

2.3 GPNMB對小膠質細胞極化的影響 同時采用免疫熒光染色與RT-PCR 檢測大鼠腦組織內小膠質細胞極化標志物，結果顯示：抑制GPNMB 會增加CD16/Iba1雙陽性細胞比例（P<0.05，圖3A）與M1極化因子iNOS、TNF-α mRNA 表達量（P<0.05，圖3C），同時降低CD206/Iba1 雙陽性細胞比例（P<0.05，圖3B）與M2 極化因子Arginase1、IL-10 mRNA 表達（P<0.05，圖3C），而過表達GPNMB則出現相反的結果（P<0.05，圖3）。提示GPNMB 可抑制小膠質細胞M1極化，促進小膠質細胞M2極化。

圖3 GPNMB表達對小膠質細胞極化的影響Fig.3 Effect of GPNMB expression on polarization of microglia

2.4 GPNMB 對PI3K/Akt 通路的影響 探討了GPNMB對PI3K/Akt通路的影響，結果發現通過抑制Gpnmb能降低大鼠腦組織PI3K 表達量與p-Akt/Akt比值（即Akt 磷酸化水平）（P<0.05），而過表達Gpnmb則能激活大鼠腦組織PI3K/Akt 通路表達（P<0.05，圖4）。

圖4 GPNMB對PI3K/Akt通路的影響Fig.4 Influence of GPNMB on PI3K/Akt pathway

2.5 抑制PI3K/Akt 通路對GPNMB 促M2 極化效應的影響 為驗證GPNMB 是否通過PI3K/Akt 通路發揮促小膠質細胞M2 極化效應，體外OGD 培養小膠質細胞，采用質粒過表達Gpnmb、同時使用LY294002抑制PI3K/Akt通路表達，測定細胞極化標志物，結果發現，抑制PI3K/Akt 通路表達可以逆轉過表達Gpnmb促進M2 極化的效應（P<0.05，圖5）。由此可見GPNMB 是通過激活PI3K/Akt 通路促進體外OGD培養的小膠質細胞M2極化。

圖5 抑制PI3K/Akt通路對GPNMB促M2極化效應的影響Fig.5 Influence of inhibiting PI3K/Akt pathway on GPNMB promoting M2 polarization

3 討論

小膠質是一種具有免疫功能的重要細胞類型，在CIS 期間能對大腦生理環境變化做出反應，小膠質細胞M1/M2 表型并存且相互對抗，在CIS 后的神經損傷與修復中發揮著重要作用［15-16］。了解小膠質細胞活動的分子機制，尋找細胞極化方向的驅動分子，可以通過定向控制小膠質細胞極化方向改善CIS結果。

本研究首先檢測到大鼠MCAO 模型腦皮質組織與OGD 干預的小膠質細胞中GPNMB 表達增加，表明缺血缺氧的微環境誘導了小膠質細胞GPNMB表達上調。MCAO 模型后3 d，神經行為學測試顯示大鼠神經功能顯著下降，腦梗死明顯，且伴隨著M1和M2 表型分子的強烈表達，表明MCAO 大鼠體內同時存在較高的炎癥水平與抗炎反應。當過表達大鼠腦組織內Gpnmb后，相較MCAO組，神經功能有所恢復，腦梗死程度減輕，且小膠質細胞傾向于M2極化，而抑制Gpnmb只能起到相反的效果。腦缺血是誘發親炎與抗炎反應的強刺激，當小膠質細胞傾向M1 極化時，會誘導促炎因子iNOS 與TNF-α 等表達，引發強烈的炎癥反應與神經細胞損傷，而當小膠質細胞傾向M2 極化時，則能誘導抗炎因子Arginase1 與IL-10 等表達，保護神經系統免受炎癥損傷［17-19］。NEAL 等［20］研究發現糖蛋白GPNMB 可通過CD44受體緩解星形膠質細胞的炎癥反應，雖然與本研究所探討的下游機制不同，但說明了GPNMB 具有神經保護的效果。

PI3K/Akt通路對于缺血環境的細胞存活具有重要意義［21］。本研究發現GPNMB 對PI3K/Akt 具有激活的作用，而在體外OGD 培養的小膠質細胞中抑制PI3K 表達抵消了Gpnmb過表達促細胞M2 極化的作用，說明GPNMB 通過激活PI3K/Akt 通路促進小膠質細胞M2 極化。NAKANO 等［22］研究發現GPNMB在缺血/再灌注損傷小鼠模型中表達上調，而過表達GPNMB顯著改善了小鼠腦梗死體積，并指出可能是通過ERK1/2 和Akt 的磷酸化實現對神經的保護作用，但該研究并未將GPNMB 與小膠質細胞極化聯系起來，而本研究從小膠質細胞極化的角度進一步豐富了GPNMB神經保護的作用機制。

綜上，體內與體外實驗數據均表明小膠質M1與M2極化趨勢具有可塑性，Gpnmb高表達能夠激活PI3K/Akt 信號通路，從而誘導缺血刺激下的小膠質細胞M2極化，減輕CIS 神經炎癥損傷。未來或可通過定向改變這些分子表達來改善CIS患者預后。