人參皂苷Rg1 調節miR-144-3p/FPR2/p38 信號通路對實驗性腦出血大鼠血腦屏障損傷和神經炎癥的影響

白雅林 方占海 丁晨哲 蘭彥平 劉帶林 齊高洋 陳 磊 王軍成

（寧夏回族自治區人民醫院，銀川 740001）

腦出血是腦實質血管破裂引起的出血，占腦卒中的20%～30%，病死率較高，腦出血后會繼發嚴重的炎癥反應及毒性損傷［1］。血腦屏障受損是腦繼發損傷的重要原因，血腦屏障可阻礙血液中的一些有害物質進入大腦進而損傷大腦，對中樞神經系統維持具有重要生物學意義［2］。因此，保護血腦屏障并降低神經炎癥是治療腦出血的方向之一。目前腦出血治療仍缺乏有效藥物，尋找保護血腦屏障、降低神經炎癥的治療方法是有待研究課題。人參對中樞神經系統、內分泌系統、心血管系統具有廣泛作用，可增強機體抵抗力，人參皂苷Rg1作為人參干燥根的提取物，具有抗炎、抗氧化應激等功效［3-4］。杜姝等［5］研究顯示，人參皂苷Rg1 可減輕癲癇大鼠海馬神經元損傷，但對腦出血患者作用的研究較少。甲酰基肽受體2（formyl peptide receptor 2，FPR2）是與神經炎癥關系密切的因子之一，在外界刺激下可介導炎癥作用，通過調控NF-κB、MAPK 等通路參與腦出血神經炎癥進展［6-7］。生信網站分析顯示miR-144-3p 與FPR2 存在靶向作用關系，且miR-144-3p 在腦出血中表達上調［8］。基于此，本研究探討人參皂苷Rg1 對實驗性腦出血大鼠血腦屏障、神經炎癥的治療作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 90 只SD 大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2021-0013；人參皂苷Rg1（B21057）、膠原酶Ⅱ（S10054）、伊文思藍（EB）（R20616）購自上海源葉生物科技有限公司；ago-miR-144-3p 由上海生工生物工程技術有限公司構建；TNF-α ELISA 試劑盒（ml002953）、IL-6 ELISA試劑盒（ml102828）、IL-1β ELISA 試劑盒（ml003057）購自上海酶聯生物科技有限公司；總RNA 抽提試劑盒（12183016）、逆轉錄試劑盒（4366597）、總蛋白提取試劑盒（89842）購自賽默飛世爾科技公司；兔源FPR2（ab203129）、p-p38（ab178867）、p38（ab170099）、GAPDH（ab9485）一抗、山羊抗兔二抗（ab6721）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型大鼠構建及分組 90 只SD 大鼠隨機分為對照組、腦出血組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組，每組18 只，除對照組外，其余各組均構建腦出血大鼠模型，即術前禁食12 h，禁水4 h，戊巴比妥鈉麻醉，于右側尾狀核（前囟0.2 mm、中線右側3 mm、深6 mm處）注射0.5 U膠原酶Ⅱ，注射完畢后留針5 min，對照組以等量生理鹽水代替［9］。術后保溫，大鼠麻醉蘇醒后采用Longa 法評分，1～3 分代表造模成功。造模成功后，人參皂苷Rg1 低劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠分別腹腔注射10 mg/kg、40 mg/kg、40 mg/kg 人參皂苷Rg1［10］，人參皂苷Rg1高劑量+ago-miR-144-3p組腦內1次注射5 μl ago-miR-144-3p，注射完畢退針，對照組、腦出血組連續7 d注射等量生理鹽水，1次/d，連續給藥14 d。

1.2.2 大鼠神經功能損傷評分 給藥前、末次給藥后各組大鼠均進行Longa 評分，0 分：無神經功能損傷；1 分：大鼠不能完全伸直前肢；2 分：大鼠一側癱瘓，存在追尾現象；3 分：大鼠不能打滾及站立；4分：大鼠無法進行自發性活動，存在意識障礙。

1.2.3 腦含水量測定 每組隨機選取6只大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取腦，電子天平測濕重，烘干后測干重，腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.4 ELISA檢測大鼠腦組織勻漿炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 每組隨機選取6只大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取腦，取大鼠部分血腫周圍組織，勻漿后按照TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒測定TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。部分血腫周圍組織修剪約1 mm3后戊二醛溶液中浸泡；部分血腫周圍組織冷凍保存。

1.2.5 大鼠血腦屏障結構觀察 選取1.2.4中戊二醛浸泡的腦組織，固定、脫水、包埋，切片（5 μm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察超微結構，每組設3個重復。

1.2.6 大鼠血腦屏障通透性觀察 每組隨機選取6 只大鼠，處死前尾靜脈注射4 ml/kg EB，1 h 后戊巴比妥鈉麻醉并斷頭處死大鼠，取右腦，稱重后添加三氯乙酸勻漿過夜，添加至含5 ml 50%甲酰胺溶液試管，孵育24 h，離心（15 000 r/min、30 min）取上清，測定632 nm 處吸光度，繪制標準曲線，以EB 含量代表血腦屏障通透性，每組設3 個重復。EB 滲出率（μg/g 腦濕重）=EB 濃度（μg/ml）×甲酰胺容積（ml）/濕重（g）。

1.2.7 qRT-PCR 檢 測miR-144-3p、FPR2 mRNA、p38 mRNA 水平 TRIzol 法提取各組大鼠腦組織RNA，逆轉錄為cDNA 后qRT-PCR 擴 增，2-??Ct分析miR-144-3p、FPR2 mRNA、p38 mRNA 相對表達，分別以U6和GAPDH為內參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.8 Western blot 檢測FPR2、p38 蛋白表達 裂解各組大鼠腦組織，15 000 r/min 離心5 min，收集上清，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒定量蛋白，行SDS-PAGE 電泳，轉膜（PVDF）后封閉（5%脫脂奶粉），添加FPR2、p-p38、p38、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶1 000），孵育過夜，添加HRP 標記的IgG山羊抗兔二抗孵育1 h，ECL試劑顯色后凝膠成像儀曝光、觀察，Image J 軟件分析FPR2、p38 蛋白灰度值，并計算其含量，每組設3個重復。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件分析數據，所有數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1 對大鼠神經功能損傷評分的影響 給藥前，與對照組相比，各組大鼠神經功能損傷評分均升高（P<0.05），各組間差異無統計學意義（P>0.05）；末次給藥后，與對照組相比，腦出血組大鼠神經功能損傷評分升高（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組大鼠神經功能損傷評分降低（P<0.05），組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠神經功能損傷評分升高（P<0.05，表2）。

表2 人參皂苷Rg1 對大鼠神經功能損傷評分的影響（±s，n=18）Tab.2 Effect of ginsenoside Rg1 on neurological injury score of rats （±s， n=18）

表2 人參皂苷Rg1 對大鼠神經功能損傷評分的影響（±s，n=18）Tab.2 Effect of ginsenoside Rg1 on neurological injury score of rats （±s， n=18）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p Before administration 0 2.55±0.311）2.52±0.341）2.56±0.351）After last administration 0 2.44±0.251）1.79±0.182）1.18±0.132）3）2.58±0.341）1.59±0.174）

2.2 人參皂苷Rg1 對大鼠腦含水量的影響 與對照組相比，腦出血組大鼠腦含水量增加（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠腦含水量降低（P<0.05），組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠腦含水量升高（P<0.05，表3）。

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦含水量的影響（±s， n=6）Tab.3 Effect of ginsenoside Rg1 on brain water content of rats （±s， n=6）

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦含水量的影響（±s， n=6）Tab.3 Effect of ginsenoside Rg1 on brain water content of rats （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

Brain water content/%74.13±8.21 84.66±9.411）72.91±8.142）67.54±7.622）3）73.82±8.164）Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p

2.3 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織勻漿炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影響 與對照組相比，腦出血組大鼠腦組織勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1 低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組大鼠腦組織勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低，組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠腦組織勻漿TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05，表4）。

表4 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Effect of ginsenoside Rg1 on TNF-α，IL-6，IL-1β levels in rat brain homogenate （±s，n=6，pg/ml）

表4 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Effect of ginsenoside Rg1 on TNF-α，IL-6，IL-1β levels in rat brain homogenate （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p TNF-α 31.75±3.48 IL-6 59.11±6.54 IL-1β 83.02±9.20 99.20±11.031）184.32±20.461）182.73±20.311）81.64±9.022）144.79±16.062）134.26±14.882）66.17±7.342）3）113.46±12.582）3）115.60±12.832）3）72.26±7.994）113.19±12.54 138.92±15.424）

2.4 人參皂苷Rg1 對大鼠血管內皮細胞的影響對照組大鼠血管內皮結構完整、薄厚均勻、無明顯水腫，內皮細胞連接緊密，吞飲小泡數量較少。腦出血組大鼠血管內皮薄厚不均多處呈水腫狀態，內皮細胞連續性消失，吞飲小泡數量增多；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組血管內皮細胞逐漸連接緊密、薄厚較為均勻，水腫減少；與人參皂苷Rg1高劑量組相比，人參皂苷Rg1高劑量+ago-miR-144-3p組血管內皮細胞損傷加重（圖1）。

圖1 人參皂苷Rg1對大鼠血腦屏障結構的影響（×15 000）Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 on structure of bloodbrain barrier in rats （×15 000）

2.5 人參皂苷Rg1 對大鼠血腦屏障通透性的影響 與對照組相比，腦出血組大鼠腦組織EB 滲出率升高（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組大鼠腦組織EB滲出率降低，組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠腦組織EB 滲出率升高（P<0.05，表5）。

表5 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織EB 滲出率的影響（±s，n=6）Tab.5 Effect of ginsenoside Rg1 on EB exudation rate of rat brain tissue （±s， n=6）

表5 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織EB 滲出率的影響（±s，n=6）Tab.5 Effect of ginsenoside Rg1 on EB exudation rate of rat brain tissue （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

EB exudation rate/（μg·g-1）9.10±1.01 35.82±3.971）22.60±2.482）14.37±1.562）3）18.92±2.094）Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p

2.6 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織miR-144-3p、FPR2 mRNA、p38 mRNA 的影響 與對照組相比，腦出血組大鼠腦組織miR-144-3p、p38 mRNA 水平升高（P<0.05），FPR2 mRNA 水平降低（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1 低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組大鼠腦組織miR-144-3p、p38 mRNA 水平降低（P<0.05），FPR2 mRNA 水平升高（P<0.05），組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p組大鼠腦組織miR-144-3p、p38 mRNA 水平升高（P<0.05），FPR2 mRNA水平降低（P<0.05，表6）。

表6 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織miR-144-3p、FPR2 mRNA、p38 mRNA的影響（±s， n=6）Tab.6 Effects of ginsenoside Rg1 on miR-144-3p， FPR2 mRNA and p38 mRNA in rat brain （±s， n=6）

表6 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織miR-144-3p、FPR2 mRNA、p38 mRNA的影響（±s， n=6）Tab.6 Effects of ginsenoside Rg1 on miR-144-3p， FPR2 mRNA and p38 mRNA in rat brain （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p miR-144-3p 1.02±0.12 2.46±0.271）1.94±0.222）FPR2 mRNA 1.01±0.09 0.17±0.021）0.42±0.052）p38 mRNA 1.01±0.11 3.16±0.351）2.46±0.262）1.17±0.132）3）0.79±0.082）3）1.52±0.172）3）1.82±0.194）0.61±0.064）1.94±0.224）

2.7 人參皂苷Rg1對大鼠腦組織FPR2、p38蛋白的影響 與對照組相比，腦出血組大鼠腦組織p-p38/p38 水平升高（P<0.05），FPR2 水平降低（P<0.05）；與腦出血組相比，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠腦組織p-p38/p38 水平降低（P<0.05），FPR2 水平升高（P<0.05），組間差異有統計學意義（P<0.05）；與人參皂苷Rg1 高劑量組相比，人參皂苷Rg1 高劑量+ago-miR-144-3p 組大鼠腦組織p-p38/p38 水平升高（P<0.05），FPR2 水平降低（P<0.05，圖2、表7）。

圖2 人參皂苷Rg1對大鼠腦組織FPR2、p38蛋白的影響Fig.2 Effect of ginsenoside Rg1 on FPR2 and p38 proteins in rat brain

表7 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織FPR2、p38 蛋白的影響（±s， n=6）Tab.7 Effects of ginsenoside Rg1 on FPR2 and p38 proteins in rat brain （±s， n=6）

表7 人參皂苷Rg1 對大鼠腦組織FPR2、p38 蛋白的影響（±s， n=6）Tab.7 Effects of ginsenoside Rg1 on FPR2 and p38 proteins in rat brain （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with intracerebral hemorrhage group， 2）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 low dose group， 3）P<0.05； compared with ginsenoside Rg1 high dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Intracerebral hemorrhage Ginsenoside Rg1 low dose Ginsenoside Rg1 high dose Ginsenoside Rg1 high dose+ago-miR-144-3p FPR2/GAPDH 1.72±0.18 0.46±0.051）0.62±0.062）1.21±0.132）3）p-p38/p38 0.12±0.01 0.84±0.091）0.71±0.082）0.57±0.062）3）0.94±0.114）0.62±0.064）

3 討論

腦出血是腦卒中的一種，屬于急性腦血管疾病，患者病死率高、預后差。血腦屏障是遍布于腦組織周圍的腦毛細血管壁構成的脈絡叢屏障，有效隔開血漿與腦脊液，可阻礙血液中的一些有害物質進入，在維護中樞神經系統生理功能方面發揮重要作用，腦出血后血液在腦實質中迅猛聚集，破壞血腦屏障穩定性，進而導致腦水腫、神經炎癥等繼發性損傷。基于血腦屏障在腦出血中的重要地位，探究有效保護血腦屏障及其損傷造成的神經炎癥的藥物對腦出血治療十分重要。

人參皂苷Rg1是人參的關鍵成分，具有抗衰老、心肌保護、抗炎等作用［11-13］。王利等［14］研究顯示，人參皂苷Rg1在新生兒缺血缺氧損傷后腦修復中起神經保護作用，HIF-1α 是干預靶點。向玥等［15］研究顯示，人參皂苷Rg1 可降低D-半乳糖所致小鼠海馬組織氧化應激及炎癥水平，并調控p53-p21 通路，對海馬神經元具有保護作用。TNF-α、IL-6、IL-1β與神經炎癥相關的血管改變有關［16］。本研究發現人參皂苷Rg1能夠顯著降低實驗性腦出血大鼠神經功能損傷評分、腦含水量、血腦屏障損傷程度、EB 滲出率、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，提示人參皂苷Rg1 可有效降低腦出血大鼠血腦屏障損傷程度及神經炎癥。

FPR2 是趨化因子受體，定位于人染色體19q13.3～13.4，在血管內皮組織中廣泛表達，在血管炎癥損傷中發揮重要作用。薛盛丁等［17］研究顯示，FPR2 基因敲除C57BL/6J 小鼠在氧誘導的視網膜病變后，視網膜中新生血管、IL-6、TNF-α 表達顯著低于野生型C57BL/6J 小鼠，涉及ERK、p38 通路。張俊等［18］研究顯示，阿司匹林可能通過激活FPR2抑制心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織炎癥反應。XIE 等［19］通過檢索PubMed 數據庫發現人參皂苷Rg1 的抗腦缺血再灌注機制涉及包括p38 通路在內的多種途徑，可調節血腦屏障。DING 等［20］研究顯示，FPR2/p38/COX2途徑是膜聯蛋白A1發揮抗雄性小鼠腦出血后神經炎癥的關鍵途徑，給予FPR2 拮抗劑后此作用消除。p38 是常見炎癥通路，在血腦屏障中也發揮作用［21］。提示FPR2/p38 途徑可能在腦出血造成的神經炎癥及血腦屏障中發揮作用。本研究顯示，人參皂苷Rg1 可增加FPR2 表達，抑制p38 活化，提示人參皂苷Rg1 可能通過促進FPR2 表達抑制p38降低腦出血大鼠血腦屏障損傷及神經炎癥。生信網站分析顯示miR-144-3p 與FPR2 有靶向作用關系，SUN 等［22］證實氧化血紅素可通過miR-144-3p 依賴性下調FPR2，加重腹膜炎小鼠炎癥損傷。miR-144-3p 在腦出血疾病中發揮重要作用，FAN 等［8］通過體內外實驗證實miR-144-3p促進腦出血誘導的繼發性腦損傷；血腦屏障損傷體外模型中miR-144呈高表達［23］；人參皂苷Rg1可通過miR-144/Nrf2/ARE 途徑保護缺血再灌注誘導的大鼠神經元損傷［24］。本研究發現人參皂苷Rg1 處理后，大鼠miR-144-3p 水平顯著下調，猜測人參皂苷Rg1 可能通過下調miR-144-3p參與FPR2/p38調控，進而降低腦出血大鼠血腦屏障損傷及神經炎癥。因此，本研究在高劑量人參皂苷Rg1處理大鼠基礎上設置了恢復試驗，過表達miR-144-3p，發現人參皂苷Rg1對腦出血大鼠血腦屏障損傷、神經炎癥的抑制作用減弱，大鼠血腦屏障損傷、神經炎癥再次加重，提示人參皂苷Rg1 可能通過下調miR-144-3p 表達激活FPR2，并抑制p38 通路活化，進而降低腦出血大鼠血腦屏障損傷及神經炎癥。

綜上，人參皂苷Rg1 可能通過調控miR-144-3p/FPR2/p38 軸參與對大鼠血腦屏障損傷及神經炎癥的抑制作用。但本研究仍存在一定不足，僅研究了人參皂苷Rg1 對FPR2/p38 的影響，人參皂苷Rg1 調控miR-144-3p 是否通過影響FPR2/p38 通路發揮作用有待進一步探索。