基于Nrf2/ARE通路探討CDDO-Im對缺血性腦卒中大鼠的神經保護作用①

郭瀟瀟 劉夢珂 劉歡歡 宋景貴 （新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，衛輝 453100）

缺血性腦卒中是最常見的致殘性疾病，其病理機制復雜，包括氧化應激、炎癥、細胞凋亡、能量代謝障礙等，其中炎癥反應在缺血性腦卒中后神經功能的損傷及修復中起著關鍵性作用，炎癥反應調控可能是缺血性腦卒中一個治療靶點［1-2］。

核轉錄因E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE）通路是機體重要的防御機制，能夠在多種模型中對炎癥刺激做出響應，并發揮保護細胞或組織的作用［3-4］。最新研究表明，Nrf2/ARE 通路的抗炎作用可能與巨噬細胞的極化有關［5-6］。小膠質細胞作為中樞神經系統的巨噬細胞，可以極化為經典激活型（M1）和替代激活型（M2 型）兩種表型，釋放不同的細胞因子，發揮促炎與抗炎的雙重作用［7-8］。因此，本課題組推測激活Nrf2/ARE通路可能通過促進小膠質細胞向M2 型轉化，在缺血性腦卒中后發揮神經保護作用，但目前關于這方面的研究還相對較少。

研究發現，CDDO-Im（2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-imidazolide）是一種人工合成的三萜類化合物，能激活Nrf2/ARE 通路［9］。本研究建立了缺血性腦卒中大鼠模型，經尾靜脈給予CDDO-Im，探究CDDO-Im 激活Nrf2/ARE 通路對大鼠腦形態、神經功能的影響，并通過分析小膠質細胞活化標志物Iba1、促炎因子IL-1β 和抗炎因子IL-4 的表達情況，進一步探究其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只質量為180～220 g 的SPF級雄性SD 大鼠，購自北京Charles River 公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006，在獨立通風籠具中飼養1周以適應實驗室環境，飼養條件為（23±1） ℃，濕度（55±3）%，12 h/12 h 明暗周期，自由飲食飲水，此次動物實驗經新鄉醫學院第一附屬醫院批準（審批號2019049）。

1.1.2 試劑 Nrf2 抗體（Abcam 公司）；IL-4 抗體、HO-1 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；IL-1β抗體（武漢云克隆科技股份有限公司）；Iba1 抗體（Cell signaling technology 公司）；CDDO-Im（Medchemexpress 公司）；TTC 染料（2，3，5-triphenyte-trazolium-chloride，TTC）（Sigma-aldrich 公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術）；胞漿胞核分離試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司）；Histone 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；β-actin抗體、辣根酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 SD 大鼠隨機分為3 組：假手術組（S 組）、卒中組（M 組）及CDDO-Im 干預組（M+C 組）。M 組及M+C 組大鼠采用大腦中動脈阻塞法（MCAO）［10］制作卒中模型，S組大鼠于相同部位切開皮膚并分離左側頸動脈后縫合處理，左側頸總動脈不插入線栓。M+C 組大鼠在行MCAO 術后連續3 d 12 h/次經尾靜脈注射64 μg/300 g 的CDDOIm，S組和M組大鼠給予等量生理鹽水。

1.2.2 神經功能評定 采用腦神經缺損癥狀評分，即Longa 評分［10］，對各組大鼠進行神經功能評定。評分越高代表神經功能缺損越明顯，選擇評分1～3分大鼠入組，最終每組入選18只以上。

1.2.3 TTC染色 取大鼠新鮮腦組織后，立即放在-20 ℃下冷凍20 min。將其切成冠狀位腦片，并放入盛有TTC 溶液的避光容器中，在37 ℃條件下染色30 min。為便于拍照，將腦片轉移至4%多聚甲醛中。梗死區域呈蒼白色，正常區域呈鮮紅色，最后采用Image J軟件計算腦梗死面積，腦梗死面積百分比=梗死區域面積/總面積×100%。

1.2.4 Western blot 取大鼠梗死側皮質區等量腦組織，使用胞漿胞核分離試劑盒提取胞核蛋白或RIPA 裂解液提取勻漿蛋白，BCA 法測定蛋白質含量。加入蛋白上樣緩沖液并變性后，使用12%SDSPAGE 分離蛋白并轉移至PVDF膜上，隨后在脫脂牛奶中封閉。洗膜后加入一抗稀釋液（Nrf2、HO-1、IL-1β、IL-4 及Iba1 抗體）在4 ℃冰箱過夜，第2 天選擇合適的二抗（辣根酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG），室溫下孵育1 h并洗膜。最后將目的條帶進行曝光，并使用Image J 軟件進行定量。結果分別用Histone H3、β-actin作為內參。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件對實驗數據進行統計、分析等處理。多組間采用單因素方差分析進行比較，兩兩之間采用LSD-t檢驗進行比較，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 給予CDDO-Im 可改善卒中大鼠的神經功能根據Longa 評分標準對各組大鼠進行神經功能評定，結果顯示S 組大鼠無神經功能缺損，Longa 評分均為0 分；M 組大鼠與S 組大鼠相比，出現不同程度的中樞神經系統功能缺損癥狀，Longa 評分為（2.333±0.767）分，集中在2～3 分，提示MCAO 造模成功；而使用CDDO-Im 干預后，M+C 組大鼠雖然也出現了運動、肢體伸展受限等癥狀，但Longa 評分整體較M組降低［（1.833±0.707）分，P<0.05］，表明CDDO-Im 可降低大鼠Longa 評分，減輕神經功能缺損癥狀。

2.2 給予CDDO-Im 能減少卒中大鼠的腦梗死面積 經過TTC 染色，并經處理后計算腦梗死面積，如圖1 所示，S 組大鼠未插入線栓，沒有出現腦梗死區域，其余兩組大鼠均出現了明顯的腦梗死區域，M組與M+C 組大鼠相比腦梗死區域顯著，表明CDDOIm可減少大鼠腦梗死面積（P<0.05）。

圖1 各組大鼠腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarct area of rats in each group

2.3 給予CDDO-Im 可激活Nrf2 通路，促進下游蛋白HO-1 的表達 使用胞核胞漿分離試劑盒分離出胞核蛋白，并用Western blot 法檢測Nrf2 水平，結果如圖2A 所示，與S 組大鼠相比，M 組大鼠胞核Nrf2水平差異無統計學意義（P>0.05），但有升高趨勢，而M+C 組大鼠Nrf2 水平較M 組大鼠升高顯著（P<0.05），提示CDDO-Im 可以促使Nrf2 入核。再次使用Western blot 法檢測大鼠勻漿蛋白中HO-1 水平，結果如圖2B 所示，與S 組相比，M 組大鼠HO-1 表達顯著升高（P<0.05），且與M 組大鼠相比，M+C 組大鼠HO-1 蛋白水平進一步升高（P<0.05），表明經過CDDO-Im 處理，可以激活Nrf2通路，上調Nrf2、HO-1的表達。

圖2 各組大鼠梗死側皮質區腦組織Nrf2/ARE 通路相關蛋白表達情況Fig.2 Expression of Nrf2/ARE pathway related proteins in infarcted cortex of rats in each group

2.4 給予CDDO-Im 能調控卒中后大鼠的炎癥反應 通過Western blot 檢測各組大鼠炎癥相關蛋白的表達情況，如圖3所示，與S組大鼠相比，M組大鼠Iba1、IL-1β、IL-4 水平均明顯升高（P<0.05），提示卒中后存在小膠質細胞激活，以及促炎及抗炎因子的釋放；給予CDDO-Im 后，Iba1、IL-1β 水平與M 組大鼠相比均明顯降低（P<0.05），而IL-4蛋白表達則較M組顯著升高（P<0.05），提示給予CDDO-Im可以減少M1型小膠質細胞表達，并促進其向M2型轉化。

圖3 各組大鼠梗死側皮質區腦組織Iba1、IL-1β、IL-4 蛋白表達情況Fig.3 Expression of Iba1，IL-1β and IL-4 proteins in infarcted cortex of rats in each group

3 討論

缺血性腦卒中是指由血栓形成或血管狹窄導致的局限性腦組織缺血，而長時間缺血可使神經系統產生不可逆性損傷，最終導致嚴重殘疾甚至死亡［1］。本研究在卒中模型的基礎上給予CDDO-Im干預，結果顯示大鼠Longa 評分整體降低，運動狀況、肢體伸展、活動狀態均有所好轉，TTC 染色顯示腦梗死區域顯著減小，表明CDDO-Im 可以對缺血性腦卒中發揮神經保護作用。

CDDO-Im 作為Nrf2/ARE 通路的激活劑被廣泛研究，在慢性腎臟病、心臟衰老等體內和體外實驗中均可以發揮預防和治療作用［11-12］。研究證實，Nrf2/ARE 通路是機體最重要的內源性防御機制，在機體受到刺激后，Nrf2 與負調控蛋白Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（kelch-1ike ech-associated protein l，Keap1）解離并入核，激活下游的保護性蛋白酶，發揮抗腫瘤、抗氧化、抗炎等保護作用［4，13-14］。本研究結果顯示腦卒中后大鼠細胞核中Nrf2 蛋白和組織勻漿中HO-1 蛋白表達均升高，但Nrf2 的升高差異無統計學意義。這與課題組的預期結果不符，但回顧以往相關研究［15-16］，缺血性腦卒中后Nrf2 及HO-1表達均上調，且AMIN 等［17］的結果與本研究一致，推測在缺血性腦卒中后早期，確實存在著內源性Nrf2的升高，但是這種Nrf2 的激活水平較低，可能并不能發揮充分的神經保護作用。CDDO-Im 干預后，大鼠胞核的Nrf2 及其下游的HO-1 均顯著升高，且差異均有統計學意義，這表明在缺血性腦卒中后，CDDO-Im 可以有效激活Nrf2/ARE 通路，并上調下游保護性蛋白酶HO-1。

缺血性腦卒中的病理機制復雜，炎癥與其發生發展密切相關，HO-1 作為Nrf2/ARE 通路的下游蛋白酶，具有強大的抗炎作用。早在1996 年，WILLIS等［18］在胸膜炎動物模型中發現誘導HO-1 酶可以預防炎癥，而抑制HO-1 酶會加劇炎癥。最近研究發現，HO-1的抗炎作用機制可能與巨噬細胞的極化有關［5-6，19］，且ZHANG 等［20］研究表明敲除小鼠HO-1 基因后M1 型巨噬細胞表達增多，M2 型巨噬細胞表達減少，而HO-1 過表達小鼠的結果則相反。小膠質細胞在缺血性腦卒中后首先被激活，被認為是中樞神經系統的巨噬細胞，具有M1 型和M2 型兩種狀態。多項實驗證實，M1型小膠質細胞可產生IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎因子，加重腦損傷；而外源性給予IL-4、IL-13 等Th2 型細胞因子，可以誘導小膠質細胞向M2 型轉化，并釋放IL-4、IL-10 和TGF-β 等抗炎因子，促進神經修復［8，21］。本研究結果顯示缺血性腦卒中發生后Iba1、IL-1β、IL-4 均增多，提示卒中后存在著小膠質細胞激活，以及促炎及抗炎因子的釋放；而使用CDDO-Im 干預后Iba1、IL-1β 的表達減少，IL-4 的表達進一步增多，這說明Nrf2/ARE 通路參與調控小膠質細胞激活后的炎癥反應，給予CDDO-Im可以抑制小膠質細胞激活，減少M1型小膠質細胞表達，致使促炎因子表達減少，并向M2 型小膠質細胞轉化，改善神經功能損傷。

綜上所述，本研究結果表明CDDO-Im 可激活缺血性腦卒中大鼠Nrf2/ARE 信號通路發揮神經保護作用，減輕腦組織損傷，這種作用可能是通過促進小膠質細胞向M2 型轉化，調控促炎與抗炎反應來實現的。這尚需更多的證據，但本研究為缺血性腦卒中后神經功能的損傷修復提供了新的思路。