半夏提取物通過AMPK/FOXO3a 信號通路對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖、凋亡的影響

黃麗萍 郭騰飛 張文青 （東莞職業技術學院衛生健康學院，東莞 523000）

哮喘是一種異質性疾病，其特征為氣道嗜酸性炎癥和支氣管組織結構變化，稱為氣道重塑［1］。氣道重塑包括許多過程，如上皮細胞破壞增加、氣道平滑肌數量增多及皮下纖維化加重［2］。因此，氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）凋亡減少可能參與哮喘重塑過程［3］。半夏提取物（extract of pinellia，EP）是從天南星科植物半夏的干燥塊莖中提取的產物，具有鎮咳、祛痰、平喘、抗菌、抗炎、抗腫瘤作用［4］。研究報道，EP 灌胃能夠治療卵白蛋白致敏小鼠變態反應性哮喘，同時抑制肺組織中TNF-α、IL-4 等炎癥因子分泌［5］。但EP 對哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響尚不清楚。因此，本研究主要探討EP 對哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響，為哮喘治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠購自廣東至遠生物醫藥科技有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2021-0057，均在溫控和光控制環境中飼養，所有動物實驗均遵循3R原則，經東莞職業技術學院動物倫理委員會批準（D210104）。EP 購自南京道斯夫生物科技有限公司；AMPK 抑制劑Compound C 購自上海意杰生物科技有限公司；MTT 檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、ECL 化學發光試劑盒均購自碧云天生物有限公司；IL-6、TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自上海一基生物試劑有限公司；兔源一抗CyclinD1、PCNA、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、AMPK、p-AMPK、叉頭框蛋白O3a（FOXO3a）、p-FOXO3a、β-actin 及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型建立 參照文獻［6］構建哮喘模型。大鼠適應性培養1周后，第1天和第8天腹腔注射含100 μg 1%卵清蛋白和200 mg氫氧化鋁的溶液1 ml 致敏，第15 天起每天給予大鼠1%卵清蛋白激發液霧化吸入激發氣道30 min，1 次/d，持續4 周，大鼠出現呼吸急促、煩躁不安、腹肌抽搐等癥狀為造模成功。對照組大鼠用生理鹽水進行致敏與霧化。

1.2.2 大鼠ASMCs 培養及鑒定 根據亓玉心等［7］方法分離大鼠ASMCs，組織貼壁法純化細胞，將ASMCs 在含20%胎牛血清的DMEM 培養基中培養。取第5 代對數生長期ASMCs，使用小鼠單克隆抗體α-肌動蛋白（α-actin）鑒定ASMCs。藥物處理前24 h，ASMCs 達到70%匯合時轉移到無血清DMEM 培養基中進行生長同步。根據參考文獻及預實驗結果，將ASMCs 分為對照組（含正常大鼠血清的培養液）、模型組（含致敏大鼠血清的培養液）、EP 組（含致敏大鼠血清和300 mg/L EP 的培養液）、Compound C 組（含致敏大鼠血清和10 mmol/L Compound C 的培養液）、EP+Compound C 組（含致敏大鼠血清、300 mg/L EP 和10 mmol/L Compound C 的培養液），37 ℃、5%CO2培養48 h后用于后續實驗［8-9］。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖活性 將2×103個細胞接種于96 孔板，孵育48 h，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μl 二甲基亞砜溶解結晶體。酶標儀檢測490 nm波長處吸光度。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞并用PBS 洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，室溫避光孵育30 min，流式細胞術檢測細胞凋亡。細胞凋亡率（%）=（凋亡細胞數/總細胞數）×100%。

1.2.5 ELISA檢測細胞上清中炎癥因子IL-6、TNF-α水平 收集上清，嚴格按照IL-6、TNF-α ELISA 檢測試劑盒說明書操作稀釋，加樣，加入酶標抗體37 ℃孵育1 h，洗滌，加入顯色劑37 ℃避光孵育15 min，終止反應，測定各孔吸光度，檢測各組上清中IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達 RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，電泳、轉膜、封 閉，加 入 一 抗CyclinD1（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、p-AMPK（1∶2 000）、AMPK（1∶1 000）、p-FOXO3a（1∶2 000）、FOXO3a（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，加入HRP 偶聯的羊抗兔二抗37 ℃孵育2 h，ECL 化學發光試劑盒觀察蛋白顯色情況，Image J 軟件分析目的蛋白灰度值。

1.3 統計學分析 采用Graph Pad Prism 6.0 軟件進行統計學分析，數據均表示為±s。單因素方差分析用于多組間比較，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠ASMCs 培養及鑒定 ASMCs 生長至85%匯合時，細胞呈長梭形，且平行生長，呈現明顯的“蜂窩狀”生長（圖1A）。免疫熒光染色顯示，98%細胞的細胞質中出現綠色熒光的肌絲，α-actin 呈陽性表達，證明所培養細胞為ASMCs（圖1B）。

圖1 大鼠ASMCs的培養（A）及鑒定（B）Fig.1 Culture （A） and identification （B） of ASMCs in rats

2.2 各組細胞增殖活性比較 與對照組比較，模型組OD490升高（P<0.05）；與模型組比較，EP組OD490降低，Compound C 組OD490升高（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C組OD490升高（P<0.05，表1）。

表1 各組細胞增殖活性比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation activities of cells in each group （±s， n=6）

表1 各組細胞增殖活性比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation activities of cells in each group （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

OD490 0.35±0.02 0.82±0.071）0.52±0.042）1.14±0.092）0.78±0.053）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C

2.3 各組細胞凋亡率比較 與對照組比較，模型組細胞凋亡率降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組細胞凋亡率升高，Compound C 組細胞凋亡率降低（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組細胞凋亡率降低（P<0.05，圖2、表2）。

表2 各組細胞凋亡率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of apoptosis rates of cells in each group （±s，n=6）

表2 各組細胞凋亡率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of apoptosis rates of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

Apoptosis rate/%18.86±2.21 6.27±1.381）14.35±1.672）2.35±0.682）8.62±1.233）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C

2.4 各組細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組CyclinD1、PCNA 蛋白表達顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達顯著降低，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達顯著升高，而Compound C 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達顯著降低（P<0.05，圖3、表3）。

表3 各組細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of expressions of proliferation-related proteins and apoptosis-related proteins in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

Cleaved-Caspase-3/β-actin 1.07±0.11 0.42±0.031）0.79±0.062）0.21±0.012）0.54±0.043）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C CyclinD1/β-actin 0.41±0.02 0.88±0.071）0.57±0.042）1.15±0.122）0.84±0.053）PCNA/β-actin 0.52±0.03 0.93±0.081）0.66±0.042）1.22±0.082）0.89±0.063）Bax/β-actin 0.69±0.04 0.28±0.021）0.54±0.052）0.12±0.012）0.36±0.023）Caspase-3/β-actin 1.36±0.21 0.69±0.071）1.08±0.122）0.37±0.032）0.81±0.063）

圖3 Western blot 檢測各組細胞CyclinD1、PCNA、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表達Fig.3 CyclinD1， PCNA， Bax， Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 protein expressions in each group detected by Western blot

2.5 各組細胞上清中炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較 與對照組比較，模型組IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，EP 組IL-6、TNF-α 水平顯著降低，Compound C組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05，表4）。

表4 各組細胞上清炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in cell supernatants of each group （±s，n=6，pg/ml）

表4 各組細胞上清炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in cell supernatants of each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

TNF-α 62.35±4.41 255.14±18.321）93.36±7.182）327.73±29.242）187.42±15.623）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C IL-6 186.67±16.67 329.42±30.371）215.55±21.022）467.73±42.212）269.94±18.793）

2.6 各組細胞AMPK/FOXO3a 通路相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水 平 顯 著 升 高，Compound C 組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a 水平顯著降低（P<0.05）；與EP組比較，EP+Compound C組p-AMPK/AMPK、p-FOXO-3a/FOXO3a水平顯著降低（P<0.05，圖4、表5）。

表5 各組細胞AMPK/FOXO3a 通路相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group （±s，n=6）

表5 各組細胞AMPK/FOXO3a 通路相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

p-FOXO3a/FOXO3a 0.93±0.08 0.38±0.021）0.74±0.062）0.16±0.012）0.37±0.023）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C p-AMPK/AMPK 1.08±0.11 0.42±0.031）0.84±0.062）0.23±0.012）0.54±0.033）

圖4 Western blot 檢測各組細胞AMPK/FOXO3a 通路相關蛋白表達Fig.4 Western blot analysis of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group

3 討論

哮喘是一種呼吸道炎癥性疾病，可能由接觸過敏原或其他環境刺激物引起，導致支氣管收縮、喘息和呼吸急促［10］。哮喘的主要病理特征為氣道重塑，而ASMCs 作為氣道重塑的主要成分，可通過自身膨脹和增殖直接參與氣道壁增厚，還通過表型轉化、遷移功能改變、炎癥因子和細胞外基質分泌促進氣道重塑［11-12］。據報道TNF-α、IL-6等炎癥因子介導哮喘氣道炎癥過程［13-14］；ASMCs 異常增殖為哮喘氣道重塑發生奠定了基礎［15］。本研究利用含致敏大鼠血清的培養液培養ASMCs，結果顯示，與對照組比較，模型組TNF-α、IL-6 水平顯著升高，細胞增殖活性升高，凋亡率降低，再次證實哮喘模型大鼠構建成功。增殖標志基因PCNA、CyclinD1 可反映細胞增殖能力強弱，其表達與增殖能力呈正相關［16-17］；Bax、Cleaved-Caspase-3是重要的促細胞凋亡基因［18］。炎癥進展與細胞凋亡關系重大，細胞凋亡率升高意味細胞數量減少，卻增加細胞內Cleaved-Caspase-3 表達，而Cleaved-Caspase-3 表達升高活化Bcl-2 家族蛋白，從而使促炎細胞分泌增強，抑制炎癥發生［19］。因此，本課題組推測TNF-α、IL-6 水平降低可能與凋亡增強導致的細胞數量減少及相關蛋白失調有關。本研究發現，與對照組比較，模型組細胞PCNA、CyclinD1 蛋白表達及TNF-α、IL-6 水平升高，而Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達降低，再次證明模型組細胞增殖與凋亡異常，也驗證了本研究前期推測。

中醫藥已廣泛用于各種疾病治療并顯示出良好療效。半夏主要含類黃酮、甾醇、糖苷和不飽和脂肪酸等活性成分，研究報道，半夏通過下調MMP2和IL-4表達改善卵清蛋白誘發的哮喘［20］；EP 可通過上調AQP5 表達減輕肺水腫，通過抑制炎癥因子TNF-α 表達實現［21］。EP 對哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響尚不清楚。本研究顯示，與模型組比較，EP 組細胞TNF-α、IL-6 水平、增殖活性降低，凋亡率升高，提示EP 可抑制哮喘大鼠ASMCs 炎癥反應及增殖，促進細胞凋亡。

AMPK/FOXO3a 在細胞增殖、凋亡中發揮重要調控作用。如澳洲茄堿通過激活AMPK/FOXO3a 軸抑制急性單核細胞白血病增殖［22］；黃芩清熱除痹膠囊含藥血清通過激活AMPK 直接磷酸化FOXO3a 增強其轉錄活性，改善類風濕關節炎患者氧化應激狀態［23］；AMPK 通過磷酸化其下游靶標FOXO3a 抑制哮喘炎癥反應［24］。本研究顯示，模型組細胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著降低，而EP 干預后細胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著升高，提示EP 可能通過激活AMPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進細胞凋亡。為驗證該推測，本研究利用AMPK 抑制劑Compound C 進行干預，結果發現，與模型組比較，Compound C 組 細 胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a 水平顯著降低，細胞增殖活性及炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著升高，細胞凋亡受抑制；與EP組比較，EP+Compound C 組細胞上述指標呈相同趨勢，證明推測正確，即EP 可能通過激活AMPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進細胞凋亡。

綜上，EP 可能通過激活AMPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進細胞凋亡。但EP 可能通過調控其他通路發揮對哮喘大鼠ASMCs 的增殖抑制及凋亡促進作用，有待進一步探究。