紫草素調節NF-κB/ERK 信號通路對膝關節骨性關節炎大鼠炎癥反應的影響

李淵深 索艷暉 謝延平 李青山 陳 軒 （邯鄲市中心醫院骨四科，邯鄲 056000）

膝關節骨性關節炎作為常見的慢性關節炎疾病，在中老年人群中發病率較高，近年來該病呈年輕化趨勢，成為人們關注的重點之一［1］。該病發病原因多種多樣，多種影響因子參與調控疾病，誘發骨關節處強烈的炎癥反應，形成腫脹和骨骼磨損，該病的治療手段較為單一，僅能通過相關藥物緩解疾病疼痛，難以根治［2］。膝關節骨性關節炎的相關作用機制尚未完全明確，因此深入探究其發病機制，研發具有針對性的治療藥物成為當前的重中之重［3］。目前已知膝關節骨性關節炎受多重影響因子調控，核轉錄因子-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）作為調控信號轉導的重要影響因子，可加速神經信號因子傳導，促進炎癥因子高表達［4］。細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）可釋放炎癥因子，加速炎癥反應［5］。NF-κB/ERK 信號通路被認為是抑制炎癥反應的潛在靶點［6］。

紫草素作為常見的中藥提取物，是中藥材紫草根的主要成分，具有多種藥物活性，已被證實可參與治療多種疾病［7］。由于其本身具有抗炎、消菌、抗病毒作用，研究者開始關注是否可以利用紫草素參與調控炎癥反應［8］。近年研究指出，紫草素可顯著下調IL-6、IL-17 等炎癥因子的表達水平，具有抑制炎癥功效［9］。本研究推測其可通過減輕膝關節骨性關節炎的炎癥反應緩解病情，但仍需進一步實驗加以證明。因此，本研究通過構建膝關節骨性關節炎大鼠模型，進一步驗證紫草素是否可以治療該病，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 72 只7 周齡SPF 級健康雄性SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，體質量（250±20） g，許可證號：SCXK（川）2019-028。本研究經邯鄲市中心醫院動物倫理委員會審核批準（審批號：20210010）。

1.1.2 主要試劑與儀器 紫草素（貨號：SS8500）購于北京索萊寶科技有限公司；尼美舒利（國藥準字：H20010751）購于湖北舒邦藥業有限公司；ERK激活劑DMU-212（貨號：HY-137977）購于MCE 公司；LPS（貨號：QN0166-LIU）；HE 染色試劑盒（貨號：ZN1970）購于北京百奧萊博生物科技有限公司；EDTA（貨號：324506）購于Merck 公司；番紅固綠染色試劑盒（貨號：120004）購于凱瑞基生物（北京）科技有限公司；血清TNF-α ELISA 檢測試劑盒（貨號：JLC2062）購于晶抗生物（上海）工程有限公司；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（貨號：BH-R101839）購于博湖生物（上海）科技有限公司；IL-6 ELISA 檢測試劑盒（貨號：kt99854）購于默沙克生物科技有限公司；GAPDH抗體（貨號：ab9485）、NF-κB p65抗體（貨號：ab32536）、p-NF-κB p65 抗體（貨號：ab76302）、ERK抗體（貨號：ab32537）、p-ERK 抗體（貨號ab201015）購于Abcam 公司；熒光定量PCR 儀（7500，ABI 公司）；凝膠成像系統（Tanon 2500，北京原平皓生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構建 隨機選取12只大鼠作為假手術組，麻醉各組大鼠，仰臥位固定于操作臺上，小心去除膝關節附近鼠毛，并進行消毒處理。手術刀切開膝關節表面皮膚，剝離組織，暴露關節腔，快速縫合假手術組表面皮膚，消毒處理。其余大鼠沿膝前交叉韌帶剪開，同時注意避免損傷軟骨組織，確保韌帶部位切開后，小心閉合，縫合皮膚后消毒處理。各組大鼠消毒處理后均用繃帶小心包扎，防止感染。術后進行關節炎指數評分，關節炎指數評分≥3 時認為具有明顯的膝關節骨性關節炎癥狀，造模成功。具體評分規則如下。0 分：關節處無損傷變形，大鼠活動能力良好；1 分：踝關節存在行動障礙，關節處輕微腫大，有炎癥反應；2 分：踝關節腫脹明顯，存在明顯炎癥；3 分：踝關節及以下部位均變形，存在重度行為障礙；4 分：喪失行動能力，部位變形嚴重。將造模成功的大鼠隨機分為關節炎組、尼美舒利組、紫草素組、紫草素+ERK 激活組、紫草素+NF-κB 激活組，每組12 只。尼美舒利組大鼠腹腔給予尼美舒利50 mg/kg，紫草素組大鼠腹腔給予紫草素80 mg/kg，紫草素+ERK激活組大鼠腹腔給予紫草素80 mg/kg 和ERK 激活劑DMU-212 10 mg/kg，紫草素+NF-κB 激活組大鼠腹腔給予紫草素80 mg/kg 和NF-κB 激活劑LPS 10 mg/kg，假手術組、關節炎組大鼠腹腔給予等劑量生理鹽水。每日腹腔注射1 次，連續處理20 d。

1.2.2 大鼠炎癥反應檢測 末次腹腔注射12 h后，進行關節炎指數評估，判斷各組大鼠關節炎病情。麻醉各組大鼠，斷頭法處死各組大鼠，剖開大鼠腹部，剝離表面組織，暴露腹主動脈，針頭刺入吸取3 ml 血漿，4 ℃、6 000 r/min 離心5 min，取上層血清。取血后，手術刀切開膝關節外皮膚，小心剝離軟骨組織，剩余凍存備用，部分用液氮處理研磨至粉，取少量制成勻漿，離心后取上層清液，按照試劑盒說明書方法檢測各組大鼠血清及軟骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.3 大鼠膝關節軟骨組織病理學觀察 凍存的軟骨組織置于4%多聚甲醛中固定，12 h 后將固定好的組織置于15%EDTA 中脫鈣處理，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規制作切片，按照HE 染色試劑盒、番紅固綠染色試劑盒說明書方法進行染色，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.4 大鼠軟骨組織NF-κB p65、ERK、p-NF-κB p65、p-ERK蛋白檢測 取出凍存備用的軟骨組織粉末少許，加入1 ml 蛋白裂解液充分振蕩裂解蛋白，加入少量蛋白提取液提取總蛋白，通過試劑盒檢測蛋白提取量，將蛋白定量后與上樣緩沖液混合加熱變性，加入孔道進行電泳，轉膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH 抗體、NF-κB p65 抗體、ERK 抗體、p-NF-κB p65 抗體、p-ERK 抗體，1∶1 500） 4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3 次，加入二抗（1∶200）室溫孵育45 min，TBST 清洗3次，將發光染料A 液和B 液混合均勻倒于膜上，浸泡1 min，隨后吸水紙吸去多余水分，置于Syngene 光密度掃描系統上進行條帶灰度分析。

1.3 統計學方法 數據表示為xˉ±s，采用SPSS22.0軟件進行統計學處理，單因素方差分析采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 用藥前后大鼠關節炎指數評分比較 用藥前后，與假手術組相比，關節炎組大鼠關節炎指數顯著升高（P<0.05）。與本組用藥前相比，假手術組、關節炎組大鼠用藥后關節炎指數差異無統計學意義（P>0.05），尼美舒利組、紫草素組、紫草素+ERK激活組、紫草素+NF-κB激活組用藥后關節炎指數顯著降低（P<0.05）。用藥后，與關節炎組相比，尼美舒利組、紫草素處理組大鼠關節炎指數顯著降低（P<0.05）；與紫草素組相比，紫草素+ERK 激活組、紫草素+NF-κB 激活組關節炎指數顯著升高（P<0.05）；尼美舒利組與紫草素處理組關節炎指數差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組用藥前后關節炎指數評分比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of arthritis index scores before and after treatment in each group （±s， n=12）

表1 各組用藥前后關節炎指數評分比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of arthritis index scores before and after treatment in each group （±s， n=12）

Note：Compared with group before medication，1）P<0.05；compared with sham operation group，2）P<0.05；compared with arthritis group，3）P<0.05；compared with shikonin group，4）P<0.05.

After medication/score 0 3.33±0.142）1.41±0.161）2）3）1.38±0.141）2）3）2.23±0.121）2）3）4）2.83±0.151）2）3）4）Groups Sham operation Arthritis Nimesulide Shikonin Shikonin+ERK activation Shikonin+NF-κB activation Before medication/score 0 3.31±0.132）3.28±0.142）3.29±0.142）3.28±0.172）3.24±0.192）

2.2 紫草素對膝關節骨性關節炎大鼠炎癥反應的影響 與假手術組相比，關節炎組大鼠血清和軟骨組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著升高（P<0.05）；與關節炎組相比，尼美舒利組、紫草素組大鼠血清和軟骨組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著降低（P<0.05）；與紫草素組相比，紫草素+ERK 激活組、紫草素+NF-κB 激活組大鼠血清和軟骨組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著升高（P<0.05）；尼美舒利組與紫草素組相比，大鼠血清和軟骨組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠血清和軟骨組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較Fig.1 Comparison of TNF-α， IL-6 and IL-1β contents in serum and cartilage tissue of rats in each group

2.3 紫草素對膝關節骨性關節炎大鼠軟骨組織病理學變化的影響 假手術組大鼠軟骨無明顯突起，細胞間排列緊密，染色區均為番紅色，無明顯失染；關節炎組大鼠軟骨出現突起，表面粗糙有凹點，染色區完全失染；尼美舒利組、紫草素組大鼠軟骨組織突起數量減少，表層逐漸光滑，細胞排列較為緊密，染色區大部分為番紅色，失染現象減少；與紫草素組相比，紫草素+ERK 激活組、紫草素+NF-κB 激活組大鼠軟骨表面突起較多，細胞排列松散，染色區幾乎完全失染；尼美舒利組與紫草素處理組大鼠病理學觀察無明顯差異，見圖2。

2.4 紫草素對膝關節骨性關節炎大鼠軟骨組織NF-κB p65、ERK、p-NF-κB p65、p-ERK 蛋白表達的影響 與假手術組相比，關節炎組大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK/ERK 水平顯著升高（P<0.05）；與關節炎組相比，尼美舒利組、紫草素處理組大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK/ERK 水平顯著降低（P<0.05）；與紫草素組相比，紫草素+ERK 激活組、紫草素+NF-κB 激活組大鼠軟骨組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK/ERK 水平顯著升高（P<0.05）；尼美舒利組與紫草素處理組相比，大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK/ERK 水平差異無統計學意義（P>0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠軟骨組織NF-κB p65、ERK 蛋白磷酸化程度比較Fig.3 Comparison of phosphorylation degree of NF-κB p65 and ERK proteins in cartilage tissue of rats in each group

3 討論

膝關節隨著年齡增長易產生炎癥反應，引發膝關節骨性關節炎，該疾病在中老年人群中發病率較高，造成行動不便，引起多種生活困擾［10］。關節炎受多種因素調控，造成炎癥因子數量增多、炎癥反應加劇，引發病痛［11］。因此評估行動能力的同時檢測體內炎癥因子水平是評估膝關節骨性關節炎病情的重要指標。本研究通過構建膝關節骨性關節炎大鼠模型，發現患有關節炎的大鼠關節炎指數評分顯著升高，血清和軟骨組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 含量也顯著升高，表明構建模型后的大鼠具有明顯的炎癥反應，且行動能力受損，具有典型的膝關節骨性關節炎癥狀，模型構建成功。

紫草素是一種應用范圍較廣的中藥提取物，具有抗炎消菌作用，被認為是治療由炎癥反應引發的一系列疾病的潛在藥物［12］。紫草素已被證實參與抑制TNF-α 活性，改變促炎細胞因子的轉錄水平，從而減弱炎癥反應［13］。紫草素還可抑制膠原誘導的關節炎小鼠中炎癥相關因子IL-18 表達，從而提高抗炎效率，緩解疾病疼痛［14］。在紫草素作用下，佐劑性關節炎大鼠的滑膜間炎癥細胞數量減少，炎癥明顯消除［15］。由以上研究結果推測紫草素可通過調節炎癥反應緩解膝關節骨性關節炎病情。本研究選用對骨關節炎具有良好治療效果的尼美舒利作為陽性對照，發現在尼美舒利和紫草素作用下，大鼠關節炎指數評分、血清和軟骨組織中TNFα、IL-6、IL-1β 含量顯著降低，表明紫草素可減輕炎癥相關因子水平，緩解炎癥和行動障礙。通過HE染色和番紅固綠染色進一步觀察病理學癥狀，發現關節炎大鼠軟骨表面粗糙，且番紅染色失染嚴重；尼美舒利和紫草素作用后，關節炎大鼠軟骨組織表面光滑，番紅染色失染現象減輕，進一步證實紫草素可緩解關節炎病變，但其具體作用機制仍有待探索。

有研究指出，NF-κB可參與調控炎癥反應，是炎癥信號通路中的關鍵蛋白，可調控并激活炎癥相關因子，促進炎癥基因表達，加速神經傳導，從而加重神經疼痛［16］。NF-κB 可參與調節類風濕關節炎，誘導炎癥因子表達，加劇關節炎病情［17］；還可參與調控ERK 并激活ERK，ERK 作為炎癥反應通路中的重要影響因子，在炎癥反應中發揮重要作用，通過藥物抑制其表達可顯著改善心肌梗死大鼠的炎癥反應，緩解心肌損傷［18］。也有研究推測NF-κB/ERK 通路參與調控類風濕關節炎，二者進一步結合促進炎癥因子釋放，并提高炎癥因子表達。紫草素可抑制NF-κB 通路基因表達，緩解急性胰腺炎大鼠的炎癥反應，改善病情［19］；還可通過抑制NF-κB/ERK 通路，進一步抑制TNF-α 引發的炎癥細胞增殖，減輕炎癥反應［20］。因而推測，紫草素可能通過調控NF-κB/ERK 通路改善膝關節骨性關節炎癥狀。本研究發現，關節炎大鼠軟骨組織NF-κB p65、ERK 的蛋白磷酸化程度顯著升高；在尼美舒利和紫草素作用下，大鼠軟骨組織NF-κB p65、ERK 的蛋白磷酸化程度顯著降低，表明紫草素很可能通過調控NF-κB/ERK通路發揮作用。為進一步驗證，本實驗在紫草素作用的同時激活NF-κB，發現與紫草素處理組相比，紫草素+NF-κB激活組大鼠NF-κB、ERK 的蛋白磷酸化程度顯著升高，與此同時，大鼠關節炎指數、血清和軟骨組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著升高，軟骨表面突起較多，細胞排列松散，染色區幾乎完全失染，進一步證實紫草素可通過抑制NF-κB/ERK 通路緩解膝關節骨性關節炎。

綜上所述，紫草素通過調控NF-κB/ERK 通路，抑制相關蛋白激活，減少炎癥相關因子TNF-α、IL-6、IL-1β 含量，從而緩解炎癥反應，保護軟骨組織，改善大鼠行為功能障礙，從而緩解病情。紫草素是否還通過其他作用通路參與調控膝關節骨性關節炎，仍有待進一步實驗加以說明。