TRIB3 激活Wnt/β-catenin 信號通路對喉癌TU686 細(xì)胞體外生長增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表達(dá)的影響①

程忠強(qiáng) 蔣成義 王 偉 強(qiáng)化龍 詹曉東 袁潤生

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠 233003）

Tribbles 假激酶3（Tribbles homolo 3，TRIB3）作為假性激酶，由于結(jié)構(gòu)上缺乏ATP 結(jié)合位點(diǎn)及催化殘基，不具備激酶相關(guān)活性，但作為銜接蛋白或支架蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，阻滯細(xì)胞周期，調(diào)控多種信號通路［1-2］。在多種惡性腫瘤中TRIB3 高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖，如在腦膠質(zhì)瘤中TRIB3 可通過激活β-catenin 信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖［3］；在結(jié)直腸癌中可通過TRIB3/β-catenin 信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，阻斷信號通路后可增強(qiáng)化療敏感性［4］。

在正常組織中，β-catenin 與軸蛋白、酪氨酸激酶1α 等形成破壞復(fù)合體，Wnt/β-catenin 信號通路處于抑制狀態(tài)［5］。在喉癌中，Wnt/β-catenin 信號通路處于激活狀態(tài)，β-catenin 等破壞復(fù)合體無法聚合，則聚合于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，從而促進(jìn)下游相關(guān)基因如Cyclin-D1 及C-myc 表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用，多種喉癌的治療措施均可以Wnt/β-catenin 為靶點(diǎn)抑制腫瘤生長［6］。但在治療過程中，免疫抑制是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，腫瘤細(xì)胞分泌多種免疫抑制分子使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，故降低免疫抑制分子表達(dá)也是治療的有效手段之一［7］。在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)TRIB3在頭頸部腫瘤中表達(dá)異常，如鼻咽癌中TRIB3表達(dá)明顯升高，并通過激活β-catenin 信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移［8］。但目前尚未在喉癌中證實(shí)其作用。為此本研究擬明確喉癌中TRIB3 的表達(dá)狀態(tài)，通過構(gòu)建敲低TRIB3表達(dá)的體內(nèi)、體外模型，研究TRIB3對喉癌的作用，并觀察其對外周免疫抑制分子表達(dá)的影響，以期成為喉癌治療的新靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系及組織 喉癌TU686 細(xì)胞及人永生化表皮細(xì)胞系HaCat購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。20 例喉癌患者的腫瘤組織及對應(yīng)癌旁組織來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，所有組織標(biāo)本于液氮中保存。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫科批字［2023］第53號），所有相關(guān)患者均簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 6周齡雄性BALB/c 裸鼠12只購自河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［SCXK（豫）2021-0018］，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院SPF級動物房中，室溫（22±2） ℃，自由進(jìn)食飲水，12 h/12 h 明暗環(huán)境節(jié)律。動物實(shí)驗(yàn)由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫科批字［2023］第53號）。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清（批號：BC20220530）購自南京Bio Channel 公司；TRIB3 抗體（批號：ab75774）、Wnt抗體（批號：ab63934）、Cyclin-D1抗體（批號：ac853）、C-myc 抗體（批號：ab51156）、βcatenin 抗體（批號：ab0023）、p-β-catenin 抗體（批號：ab4030）、GAPDH 抗體（批號：ab181602）購自美國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（批號：23002492）購自武漢三鷹技術(shù)有限公司；TRIB3 siRNA 購自廣州銳博公司；CCK-8 試劑盒（批號：2022060721）購自上海圣爾生物有限公司；流式細(xì)胞學(xué)試劑盒（批號：E0015-1643）購自美國eBioscience 公司；Trizol 試劑（批號：RR420A）、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNase HPlus）（2×）（批 號：RR390A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（5×Prime Script RT Master Mix）（批號：RR037A）購自日本TaKaRa 公司；TRIB3及GAPDH 引物購自上海生工生物；IL-4（批號：20210513）、IL-6（批號：20200823）、IL-10（批號：20210609）、TGF-β（批號：20220115）、前列腺素（prostaglandin E2，PGE2）（批號：20220309） ELISA試劑盒購自武漢基因美生物有限公司；TRIB3 低表達(dá)慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉凱化學(xué)技術(shù)有限公司。其余所用實(shí)驗(yàn)試劑均購自國產(chǎn)相關(guān)試劑公司。

1.1.4 主要儀器 Western blot 電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Western blot成像系統(tǒng)購自美國Alpha-Innotech 公司；熒光定量PCR 儀及恒溫培養(yǎng)箱購自賽默飛有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；超凈工作臺購自美國Sigma 公司；倒置顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 TU686 及HaCat 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640中，置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將TU686 細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，分為陰性對照組（NC組）及敲低TRIB3組（sh-TRIB3組），待細(xì)胞增至70%時棄去培養(yǎng)上清，PBS 清洗后各孔加入無血清1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；將250 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基與160 pmol 的siRNA 或NC-RNA 充分混勻至1.5 ml EP 管中；另取一只1.5 ml EP 管，將250 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基與5 μl Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置5 min；再將上述兩個EP管中的內(nèi)容混合，室溫靜置30 min。將混勻的液體加入上述6孔板內(nèi)，6 h后PBS清洗，更換完全培養(yǎng)基。

1.2.1.2 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 將喉癌組織、癌旁組織及經(jīng)1.2.1.1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別加入蛋白酶抑制劑和PMSF，離心取上清，加入上樣緩沖液，充分混勻后煮沸變性，-20 ℃冰箱冷凍。配制10%SDS-PAGE 凝膠，待膠凝之后放置于電泳液中，加入20 μl細(xì)胞總蛋白，設(shè)置電壓120 V分離80 min，隨后設(shè)置80 V 分離60 min，取出玻璃板，按照目標(biāo)蛋白的分子量取膠，使用轉(zhuǎn)膜夾及轉(zhuǎn)膜液將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，將其放置于5%BSA 溶液中脫色封閉，TBS 清洗10 min×3 次，脫脂牛奶封閉4 h，清洗后放入對應(yīng)一抗中，4 ℃孵育過夜，次日取出后條帶搖床清洗，隨后二抗4 ℃孵育1 h，洗膜。將膜均勻涂抹AB（1∶1）顯影液，放入顯影系統(tǒng)，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.1.3 實(shí)時熒光定量PCR 利用Trizol 試劑提取喉癌、癌旁組織及經(jīng)1.2.1.1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總RNA，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，取2 μl cDNA為模板，配制25 μl Real-time PCR 反 應(yīng) 體 系 進(jìn) 行 擴(kuò) 增：2×Super Real Premix 12.5 μl；正、反向引物（10 μmol/L）各0.75 μl；RNase-free ddH2O 9 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)。TRIB3-F：5'-GCTTTGTCTTCGCTGACCGTGA-3'，TRIB3-R：5'-CTGAGTATCTCAGGTCCCACGT-3'；內(nèi)參GAPDH-F：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，GAPDH-R：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。

1.2.1.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測增殖能力 將1.2.1.1轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞消化后接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后分別于0 h、24 h、48 h 及72 h 在各孔中加入10 μl CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，將96 孔板置于酶標(biāo)儀上測定450 nm處吸光度值。

1.2.1.5 細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn) 將1.2.1.1 轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞消化后，以10 000 個/孔接種于6 孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞集落形成情況并拍照。

1.2.1.6 細(xì)胞周期檢測 將1.2.1.1 轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞消化后收集至EP管中，PBS清洗后，1 500 r/min離心5 min，去除上清，每管加入2 ml 預(yù)冷的75%乙醇，振蕩混勻，置于-20 ℃冰箱固定過夜，1 500 r/min離心5 min 后去除上清，PBS 清洗重懸，加入5 μl 碘化丙啶及RNA 酶，室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 移植瘤小鼠模型構(gòu)建 12只雄性BALB/c裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為Control sgRNA 組和TRIB3 sgRNA 組。設(shè)計構(gòu)建TRIB3 低表達(dá)（TRIB3+ShNC）及對照（Vector+shNC）的TU686細(xì)胞系，100 μl PBS懸浮后（3×106個細(xì)胞/皮下瘤）注入腋窩，期間觀察小鼠生存狀態(tài)，注射5 周后，眼球取血處死小鼠，去除瘤體，稱重并測量瘤體體積。

1.2.2.2 ELISA 檢測外周免疫抑制分子含量 將1.2.2.1 收集的血液離心取上清。按照試劑盒說明書檢測兩組血清中免疫抑制因子IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、PGE2含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用±s表示，兩組間比較釆用t檢驗(yàn)，Pearson 分析比較蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TU686 細(xì)胞及喉癌組織中TRIB3 表達(dá) 與正常細(xì)胞相比，喉癌TU686 細(xì)胞中高表達(dá)TRIB3（圖1A、B）；與癌旁組織相比，喉癌組織中TRIB3 蛋白及mRNA 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖1C、D）。

圖1 TU686細(xì)胞及喉癌組織中TRIB3表達(dá)Fig.1 Expression of TRIB3 in TU686 cells and laryngeal carcinoma tissue

2.2 TU686 細(xì)胞中敲低TRIB3 后結(jié)果驗(yàn)證 與正常細(xì)胞相比，喉癌TU686 細(xì)胞中高表達(dá)TRIB3。與NC 組 相 比，轉(zhuǎn) 染TRIB3 siRNA 后TU686 細(xì) 胞 中TRIB蛋白及RNA表達(dá)量明顯減少（P<0.01，圖2）。

圖2 TU686細(xì)胞中敲低TRIB3后結(jié)果驗(yàn)證Fig.2 Verify the results after TRIB3 knockdown in TU686 cells

2.3 敲低TRIB3 對TU686 細(xì)胞生長增殖的影響CCK-8 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示，與NC 組 相 比，sh-TRIB3 組TU686細(xì)胞增殖活力顯著降低（P<0.01，圖3A）。集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-TRIB3 組細(xì)胞的集落克隆能力顯著降低（P<0.01，圖3B）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC 組相比，sh-TRIB3 組細(xì)胞S 期細(xì)胞數(shù)占比較低，生長被阻滯于G1/S期（圖3C）。

圖3 敲低TRIB3對TU686細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of TRIB3 knockdown on proliferation ability of TU686 cells

2.4 敲低TRIB3 后對Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的影響及其相關(guān)性分析 與NC 組相比，sh-TRIB3 組TU686 細(xì)胞中Wnt、β-catenin 及其下游效應(yīng)蛋白Cyclin-D1 及C-myc 表達(dá)明顯下降，p-βcatenin 表達(dá)明顯上升（P<0.05 或P<0.01，圖4A）。相關(guān)性研究顯示，TRIB3 表達(dá)與Wnt、β-catenin、p-βcatenin 及其下游效應(yīng)蛋白Cyclin-D1 表達(dá)呈明顯相關(guān)性（P<0.05，圖4B）。

圖4 敲低TRIB3 對Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的影響及其相關(guān)性分析Fig.4 Effects of TRIB3 knockdown on Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins and correlation analysis

2.5 裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證敲低TRIB3 對腫瘤生長及生存期的影響 如圖5 所示，與Control sgRNA 組相比，體內(nèi)敲低TRIB3 后瘤體生長速度減慢，注射5周后，腫瘤的體積及重量均明顯降低（P<0.05）。

2.6 裸鼠移植瘤模型檢測敲低TRIB3 對外周免疫抑制分子表達(dá)的影響 與Control sgRNA 組相比，敲低TRIB3 后小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、PGE2含量均明顯降低（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠外周血免疫抑制分子蛋白水平（±s，n=6， pg/ml ）Tab.1 Levels of immunosuppressive molecular protein in peripheral blood of mice in each group （±s，n=6， pg/ml ）

表1 各組小鼠外周血免疫抑制分子蛋白水平（±s，n=6， pg/ml ）Tab.1 Levels of immunosuppressive molecular protein in peripheral blood of mice in each group （±s，n=6， pg/ml ）

Note：Compared with Control sgRNA group， 1）P<0.01.

PGE2 21.69±3.79 10.67±1.381）Groups Control sgRNA TRIB3 sgRNA IL-4 56.66±6.41 32.82±6.621）IL-6 52.31±7.00 32.43±2.961）IL-10 58.56±7.84 40.20±4.691）TGF-β 404.40±15.00 317.39±45.041）

3 討論

蛋白激酶在人體中的主要作用是催化磷酸基從ATP 轉(zhuǎn)移到其底物，500 多種人類激酶組中約有10%已被認(rèn)為是假性激酶［9］。TRIB3是TRIB家族成員，由于缺乏與ATP 親和位點(diǎn)及激酶活性的保守催化單元，故并無激酶活性，因此也被認(rèn)為是假性激酶的一種，但可能通過競爭相同的肽底物和控制其生物活性調(diào)節(jié)其他激酶［10］。TRIB3表達(dá)于人體各個器官，在骨髓、外周血白細(xì)胞和甲狀腺中均有極高的表達(dá)水平［11］。TRIB3 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)眾多生理功能，包括細(xì)胞的壓力反應(yīng)、細(xì)胞的分化和增殖、脂質(zhì)和葡萄糖的代謝、上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變［12］。在惡性腫瘤中，TRIB3 可通過激活經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或作為折疊蛋白，結(jié)合靶蛋白的E3 連接酶影響靶蛋白泛素化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長［13］。研究顯示TRIB3 在各種惡性腫瘤中均表達(dá)升高，可能是腫瘤形成過程中的關(guān)鍵因素，目前在肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌中研究較多，但結(jié)果不一。研究表明，在乳腺癌中TRIB3 可同時作為致癌因素及抗癌因素，如TRIB3 mRNA 高表達(dá)表明乳腺癌預(yù)后較差，而TRIB3 蛋白高表達(dá)則有利于預(yù)后［14-15］。但在其他腫瘤中尚未發(fā)現(xiàn)此種預(yù)示作用。

在頭頸部惡性腫瘤中，TRIB3 在鼻咽癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)異常升高，并分別激活β-catenin及AKT 信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移等［8，16］。喉癌作為常見的頭頸部腫瘤，臨床治療效果不佳，最終均會以復(fù)發(fā)或耐藥作為治療終點(diǎn)，因此在喉癌中尋找新的治療靶點(diǎn)可能是其治療的新思路之一［17］。本研究發(fā)現(xiàn)在喉癌細(xì)胞及腫瘤組織中存在TRIB3異常高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，敲低TRIB3后細(xì)胞增殖被明顯抑制，腫瘤細(xì)胞被阻滯在G1/S 期，同時細(xì)胞集落生成能力降低。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也佐證了上述結(jié)果，敲低TRIB3 的移植瘤小鼠注射5 周后，瘤體大小、體積及重量均明顯降低，提示TRIB3可誘導(dǎo)腫瘤的生長增殖，通過靶向抑制TRIB3 可延緩瘤體生殖速度。Wnt/β-catenin信號通路的激活是腫瘤的發(fā)生機(jī)制之一，Wnt 及β-catenin 在多種腫瘤中表達(dá)升高，其中Wnt為胞外關(guān)鍵調(diào)控蛋白，β-catenin則在胞內(nèi)發(fā)揮信號傳遞作用，影響下游功能蛋白Cyclin-D1 及C-myc 等的表達(dá)［18］。本研究結(jié)果顯示，TRIB3 促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號通路及下游蛋白如Cyclin-D1 及C-myc 等表達(dá)，而降低β-catenin 的磷酸化水平，敲低TRIB3 后則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，提示TRIB3在喉癌中可激活Wnt/β-catenin 信號通路。相關(guān)性研究顯示，在正常及敲低TRIB3 細(xì)胞中TRIB3蛋白表達(dá)與Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明TRIB3 在喉癌中通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。

腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞可分泌多種免疫抑制分子，產(chǎn)生的免疫抑制可使體內(nèi)的免疫細(xì)胞無法準(zhǔn)確識別或殺傷腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如PD-1，即可通過恢復(fù)機(jī)體正常免疫功能達(dá)到抗腫瘤作用［19］。但由于腫瘤組織可分泌多種外周免疫抑制因子，尋找有效的降低免疫抑制因子的途徑也是抗腫瘤治療的思路之一。為此本實(shí)驗(yàn)選取了5種常見的外周免疫因子，在移植瘤小鼠中探討TRIB3 與外周免疫抑制因子的關(guān)系。IL-4 高表達(dá)于多種腫瘤組織，參與炎癥反應(yīng)的同時還可在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，IL-4 可抑制Th1 細(xì)胞產(chǎn)生及γδT 細(xì)胞的活化與應(yīng)答，在促進(jìn)免疫抑制因子IL-10 生成的同時，自身向免疫功能較差的Vδ1T 細(xì)胞偏移，導(dǎo)致免疫抑制發(fā)生［20］。IL-6可抑制自然殺傷細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞活性，阻礙免疫T 細(xì)胞功能，誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞漂移，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)，促進(jìn)IL-10 及PGE2 合成，參與免疫逃逸，通過誘導(dǎo)血管生成等機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［21］。IL-10 可通過抑制T 淋巴細(xì)胞的應(yīng)答及活化、降低細(xì)胞黏附分子及協(xié)同刺激分子CD86表達(dá)、抑制抗原呈遞功能等引起腫瘤免疫逃逸環(huán)境［22］。除IL-10 的類似作用外，TGF-β 還可抑制Th1細(xì)胞因子的應(yīng)答及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的分化裂解，抑制嗜中性粒細(xì)胞及NK 細(xì)胞功能，并誘導(dǎo)Th2細(xì)胞漂移，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸發(fā)生［23］。PGE2高表達(dá)于腫瘤組織中，通過抑制B、T 淋巴細(xì)胞增殖，抑制Th1 細(xì)胞因子的合成及NK 細(xì)胞功能，誘導(dǎo)并促進(jìn)IL-10 產(chǎn)生及Th2 細(xì)胞因子合成，產(chǎn)生腫瘤免疫微環(huán)境，并使機(jī)體免疫功能發(fā)生障礙［24］。本研究表明體內(nèi) 敲 除TRIB3 可 降 低IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β 及PGE2 表達(dá)，提示TRIB3 參與了腫瘤免疫反應(yīng)，抑制TRIB3表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境。

綜上所述，抑制TRIB3 表達(dá)可抑制喉癌細(xì)胞的生長增殖，此作用可能是通過激活Wnt/β-catenin 信號通路實(shí)現(xiàn)的，同時TRIB3 在體內(nèi)可促進(jìn)腫瘤免疫障礙生成。抑制TRIB3靶點(diǎn)的治療方式可為喉癌的防治提供新思路。