基于生物信息學方法分析SHCBP1基因在肺腺癌中的表達及臨床意義①

連巖巖 萬宇翔 李麗玲 張春光 黃金昶 （北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京100029）

肺癌是發病率及病死率最高的癌癥之一，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是一種常見的肺癌病理亞型，其發病隱匿，具有早期轉移趨勢，確診時多處于晚期，五年生存率僅為15%［1-3］。因此，挖掘新的與LUAD 發生發展密切相關的基因，對于改善患者預后具有重要意義。

SHC 蛋白被認為是與細胞表面受體相關的結合蛋白，在信號傳導和疾病發生中發揮重要作用，SHC 的SH2 結 構 域 結 合 蛋 白1（SHC SH2-binding protein 1，SHCBP1）是SHC 蛋白SH2 結構域上的重要連接蛋白［4］。SHCBP1參與多種腫瘤的發生發展，并可調節FGF、NF-κB、PI3K/AKT、TGF-β1/Smad 等多種信號通路［4］。目前關于SHCBP1 在LUAD 中表達的相關研究較少，本研究利用多種常用公共數據庫中LUAD 的臨床數據，挖掘SHCBP1在LUAD 中的表達水平及其與LUAD預后的關系，并評估SHCBP1與腫瘤浸潤性免疫細胞、免疫標志物及免疫檢查點的相關性，為臨床進一步深入探究SHCBP1在LUAD發生發展中的作用及免疫細胞浸潤提供參考。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數據庫 Oncomine 數據庫（https：//www.oncomine.org）是目前世界上最大的在線癌基因芯片數據庫和整合數據挖掘平臺，可對正常組織和腫瘤組織的差異表達基因進行分析［5］。根據本研究需求，設定具體篩選條件：①gene：輸入SHCBP1；②Analysis Type：選擇Cancer vs Normal Analysis；③Cancer Type：選擇Lung Cancer；④Data Type：mRNA；⑤臨 界 值 設 定：P<0.000 1，FOLD CHANGE>2，GENE RANK=10%，分析SHCBP1 mRNA 在腫瘤組織與正常組織間的表達差異。

1.2 TIMER 數 據 庫 TIMER 數 據 庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）提供了腫瘤浸潤免疫細胞的全面分析和可視化功能，可系統性地分析不同癌癥類型免疫細胞浸潤［6］。通過反卷積方法估算腫瘤組織中6 種免疫細胞（B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）浸潤的豐度。本研究用Diff Exp 模塊分析SHCBP1 mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達差異；Gene 模塊分析SHCBP1 mRNA 表達和各種免疫細胞浸潤的關系；Survival 模塊分析腫瘤免疫細胞浸潤水平對LUAD 患者預后的影響；Correlation 模塊分析SHCBP1 mRNA與LUAD免疫浸潤細胞標志物、免疫檢查點之間的相關性。

1.3 GEPIA 數據庫 GEPIA 數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大學開發的交互式Web 服務器，提供基因差異表達分析、輪廓圖繪制、相關性分析、生存分析等功能［7］。本研究應用GEPIA 分析SHCBP1 mRNA 在LUAD 組織中的表達水平及其對LUAD 患者預后的影響，進一步分析SHCBP1 mRNA與免疫檢查點間的關系。

1.4 UALCAN 數 據 庫 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）是癌癥基因組學門戶網站［8］，數據主要來源于TCGA 數據庫，可用于分析基因在腫瘤和正常樣本中的差異性表達，同時可以比較不同腫瘤臨床特征與基因表達的相關性。使用該網站分析LUAD患者的臨床特征與SHCBP1 mRNA表達情況。

1.5 Kaplan-Meier plotter 數 據 庫 Kaplan-Meier plotter （www.kmplot.com）在線數據庫是一個腫瘤預后分析的在線網站［9］，用于評估SHCBP1 mRNA表達對LUAD患者預后的影響。

1.6 STRING 數據庫 通過STRING 數據庫分析與SHCBP1 有相關作用的基因及蛋白，并進行KEGG通路富集分析，以期預測SHCBP1 發揮作用的可能機制。

2 結果

2.1 SHCBP1 在常見惡性腫瘤中的表達情況 在Oncomine 數據庫中，根據篩選條件分析了不同腫瘤和各正常組織中SHCBP1 mRNA 的表達水平，結果提示共有293 項不同類型的研究結果（圖1A），其中差異有統計學意義的研究結果有54 項，SHCBP1 mRNA 表達增高的研究有49 項，表達降低的研究有5項，紅框中是SHCBP1 mRNA 在肺癌中的差異表達情況，顯示SHCBP1 mRNA 在肺癌中高表達。采用TIMER 數據庫進一步比較SHCBP1 mRNA 在不同腫瘤組織和正常組織中的表達差異，發現LUAD 中SHCBP1 mRNA 表達明顯高于正常肺組織，差異有統計學意義（P<0.001，圖1B）。

圖1 SHCBP1 mRNA在不同腫瘤中的表達Fig.1 Expression of SHCBP1 mRNA in different tumors

2.2 LUAD 中SHCBP1 mRNA 的表達情況 在Oncomine 數據庫中，通過上述檢索條件，共找到3 項關于LUAD 和正常肺組織中SHCBP1 芯片表達的研究（表1）。薈萃比較結果提示（圖2A），相比正常肺組織，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中的表達顯著升高（Median Rank=594，P<0.000 1）。通過GEPIA 數據庫，在LUAD 組織中進一步驗證SHCBP1 的轉錄水平，結果證實SHCBP1 mRNA 在LUAD 組織中表達明顯升高（圖2B）。

表1 Oncomine 數據庫中SHCBP1 在LUAD 與正常肺組織中的表達水平Tab.1 Expression level of SHCBP1 in Oncomine database in LUAD and normal lung tissues

圖2 SHCBP1 mRNA在LUAD中的表達Fig.2 SHCBP1 mRNA expression in LUAD

2.3 SHCBP1 與LUAD 臨床特征的關系 通過UALCAN 數據庫對LUAD 患者的SHCBP1 mRNA 水平與臨床特征的關系進行分析。結果顯示，與正常肺組織相比，SHCBP1 mRNA 在高加索人、非裔美國人、亞洲人種均表達上升，差異有統計學意義（P<0.01），而各人種間差異無統計學意義（圖3A）；吸煙患者與戒煙患者SHCBP1 mRNA 表達均明顯上升（P<0.01），提示SHCBP1 mRNA 表達上升與有吸煙史密切相關（圖3B）；男性和女性SHCBP1 mRNA 表達差異無統計學意義（圖3C）；SHCBP1 mRNA 表達與淋巴結轉移密切相關，N0、N1、N2 期SHCBP1 mRNA表達均顯著高于正常肺組織（P<0.000 1），N3與N2相比有上升趨勢，但差異無統計學意義（圖3D）；Ⅰ期與Ⅲ期和Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表達差異有統計學意義（P<0.05），Ⅲ期與Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表達相比有上升趨勢，提示分期越晚SHCBP1 mRNA 表達水平越高（圖3E），表明可依據SHCBP1 mRNA 表達水平作為判斷分期的指標；存在TP53 突變的LUAD 組織中SHCBP1 mRNA 表達明顯高于不存在TP53突變的LUAD組織（P<0.000 1，圖3F）。

圖3 SHCBP1 mRNA與LUAD患者臨床特征的關系Fig.3 Relationship between SHCBP1 mRNA and clinical features of LUAD patients

2.4 SHCBP1 mRNA 表達與LUAD 患者預后的關系 GEPIA 數據庫分析SHCBP1 mRNA 表達與LUAD 患者預后的關系。預后分析結果顯示，與SHCBP1 mRNA 低表達組相比，SHCBP1 mRNA 高表達組LUAD 患者總生存期顯著降低（HR=1.8，P<0.001，圖4A），結果通過Kaplan-Meier plotter 數據庫得到驗證（HR=1.72，P<0.000 1，圖4B），表明SHCBP1 mRNA高表達的LUAD患者預后較差。

圖4 SHCBP1 mRNA表達與LUAD患者預后的關系Fig.4 Relationship between expression of SHCBP1 mRNA and prognosis of LUAD patients

2.5 SHCBP1 的蛋白互作網絡及KEGG 通路富集分析 通過STRING 數據庫對SHCBP1 進行蛋白互作網絡構建，根據蛋白關聯性共獲得與SHCBP1 相關的蛋白10個，該網絡平均連接度為8.36，SHCBP1的連接度為10，為網絡的核心（圖5）。KEGG 通路富集發現，存在5個與免疫密切相關的條目（表2）。

表2 SHCBP1相互作用蛋白的KEGG通路富集分析Tab.2 KEGG pathway enrichment analysis of SHCBP1 interacting proteins

圖5 SHCBP1相關基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡Fig.5 Protein-protein interaction network of SHCBP1 related genes

2.6 LUAD 中免疫細胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA表達的關系 利用TIMER 數據庫檢測LUAD 中腫瘤免疫細胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA 表達的相關性（圖6）。在LUAD 中，SHCBP1 mRNA 表達與腫瘤純度呈負相關（cor=-0.098，P<0.05），與B細胞浸潤呈負相關（cor=-0.141，P<0.01），與CD8＋T細胞（cor=0.120，P<0.01）、中性粒細胞（cor=0.243，P<0.000 1）和樹突狀細胞（cor=0.132，P<0.01）的浸潤呈正相關。

圖6 LUAD中免疫細胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA表達的關系Fig.6 Relationship between immune cell infiltration level and SHCBP1 expression in LUAD

2.7 LUAD中SHCBP1 mRNA表達水平與免疫細胞浸潤程度對預后的影響 利用TIMER 數據庫生成Kaplan-Meier 曲線，以研究SHCBP1 mRNA 表達水平與免疫細胞浸潤程度對LUAD 預后的影響（圖7）。結果發現B 細胞浸潤（P<0.001）、樹突狀細胞浸潤（P=0.048）和SHCBP1 mRNA 表 達（P<0.001）與LUAD 預后顯著相關，B 細胞、樹突狀細胞浸潤低的LUAD 患者預后較差，SHCBP1 高表達的LUAD 患者預后較差。

2.8 LUAD中SHCBP1 mRNA表達與不同類型免疫細胞標志物的相關性 本研究利用TIMER 數據庫探討了LUAD 中SHCBP1 mRNA 表達水平與不同類型免疫細胞標志物的相關性，包括CD8+T 細胞、B 細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、Th1 細胞、Th2 細胞、濾泡輔助性T細胞、輔助性T 細胞17、Treg 細胞和T 細胞耗竭標志物（表3）。經腫瘤純度校正后發現，LUAD 中的SHCBP1 表達水平與CD8+T 細胞、單核細胞、腫瘤相關巨噬細胞、M2 型巨噬細胞、T 細胞耗竭表面標志物呈正相關（0.1≤cor≤1.0，P<0.05）。

表3 LUAD中SHCBP1與免疫細胞標志物的相關性Tab.3 Correlation between SHCBP1 and immune cell markers in LUAD

2.9 SHCBP1 mRNA與LUAD免疫檢查點的關系由于PD-1/PD-L1 和CTLA-4 是負責腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點?？紤]到SHCBP1 在LUAD 中的潛在致癌作用，應用TIMER 評估了SHCBP1 mRNA 與PD-1、PD-L1 和CTLA-4 的關系。經腫瘤純度校正后發現，SHCBP1表達與LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的表達呈顯著正相關（圖8A、C、E），且結果通過GEPIA 數據庫得到了驗證（圖8B、D、F）。提示腫瘤免疫逃逸可能與SHCBP1介導的LUAD發生有關。

圖8 SHCBP1與LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的相關性Fig.8 Correlation of SHCBP1 expression with PD-1， PDL1 and CTLA-4 expressions in LUAD

3 討論

本研究利用多個數據庫分析了LUAD 組織和正常肺組織中SHCBP1 的表達水平及其與LUAD 臨床特征、預后及腫瘤免疫浸潤的關系。結果發現，與正常肺組織相比，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中高表達，且SHCBP1 mRNA 表達與有吸煙史、淋巴結轉移、TP53 突變密切相關。HU 等［13］研究發現吸煙顯著影響P53 信號通路，可能有助于LUAD 的發病。此外本研究發現LUAD分期越晚，SHCBP1 mRNA表達水平越高，提示可依據SHCBP1 表達水平作為判斷分期的指標。生存分析發現SHCBP1 mRNA 的高表達與LUAD 患者較差的總生存期顯著相關。WANG 等［14］研究發現SHCBP1 的表達可能在肺癌中上調；ZOU 等［15］研究發現SHCBP1 高表達的肺癌患者預后較差。這些結果與本研究的發現大致相符，提示SHCBP1 高表達與LUAD 的發生發展及不良預后有關，但具體機制尚不清楚。

肺癌的發展是一個復雜的過程，涉及腫瘤細胞、基質成纖維細胞和免疫細胞間的相互作用，腫瘤浸潤免疫細胞在促進或抑制腫瘤生長中起重要作用，癌癥的惡性表型與腫瘤浸潤免疫細胞密切相關［16-17］。通過STRING 構建SHCBP1 相關蛋白網絡，并進行KEGG 通路富集分析，結果顯示有5 條通路與免疫密切相關，包括病毒致癌、人類T細胞白血病病毒1 感染、細菌入侵上皮細胞、NK 細胞介導的細胞毒性、乙型肝炎通路，SHCBP1 可能通過調控上述通路影響LUAD 的發生發展和免疫浸潤。本研究進一步挖掘了SHCBP1 mRNA 與LUAD 免疫浸潤的關系，結果顯示SHCBP1 mRNA 的表達水平與腫瘤純度、B 細胞浸潤呈負相關，與CD8+T 細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤呈正相關。提示SHCBP1可能參與對LUAD 腫瘤微環境的免疫應答，尤其是對B 細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的免疫應答。另外，經腫瘤純度校正后發現SHCBP1 mRNA 的表達與大部分免疫標志物顯著相關，尤其與CD8+T細胞、單核細胞、腫瘤相關巨噬細胞、M2型巨噬細胞、T 細胞耗竭表面標志物表達水平有很強的正相關性，表明SHCBP1 可能通過調節以上免疫細胞影響LUAD 的免疫浸潤。越來越多的證據表明，高水平CD4+T、CD8+T、樹突狀細胞和B 細胞浸潤的LUAD 患者預后較好［18-19］。本研究經TIMER 數據庫生存分析發現，B 細胞浸潤低的LUAD 患者預后較差。肺癌發展的所有階段均觀察到腫瘤浸潤性B細胞，其分泌抗體激活補體級聯和NK 細胞以殺死腫 瘤 細 胞［16，20］。M2 極 化 的 巨 噬 細 胞 在 體 內 促 進LUAD 細胞的侵襲、遷移和轉移［21］。因此，SHCBP1過表達可能抑制LUAD 中B 細胞的浸潤，促進M2 型巨噬細胞浸潤，并最終加速LUAD進展。SHCBP1在LUAD 患者中的高表達可能觸發抗腫瘤免疫反應，提示SHCBP1在LUAD的免疫調節中起重要作用。

腫瘤免疫逃逸使腫瘤細胞通過多種機制逃避免疫系統的識別和攻擊，導致其增殖和轉移［22］。免疫治療的療效不僅需要腫瘤微環境中有足夠的免疫細胞浸潤，還取決于免疫檢查點的充分表達［23］。有研究表明具有TP53 突變的非小細胞肺癌患者在接受免疫檢查點阻斷治療后有更好的預后，CD8+T細胞浸潤水平較高的患者更有可能從免疫治療中獲益，并且有研究發現腫瘤PD-L1 表達與CD8+T 細胞計數顯著正相關［24-26］。本研究中SHCBP1 mRNA表達與TP53 突變和CD8+T 細胞浸潤顯著正相關。因此本研究評估了SHCBP1 mRNA 與免疫檢查點間的關系，結果表明SHCBP1 mRNA 高表達與LUAD中的PD-1、PD-L1和CTLA-4呈正相關。以上結果表明SHCBP1可能通過增加免疫檢查點表達發揮其致癌作用，靶向SHCBP1 可能提高LUAD 免疫治療的療效。

綜上所述，本研究探討了SHCBP1 作為LUAD生物標志物的潛力及其在腫瘤細胞浸潤中發揮的作用。但受數據庫數據限制本研究也存在一定的局限性，SHCBP1 mRNA 轉錄與蛋白表達的一致性仍有待進一步明確，未來仍需應用分子生物學方法通過體內外實驗加以驗證。