嵌套EP管法更快速獲取更多小鼠骨髓細(xì)胞①

徐啟英 王卓亞 冶 怡 烏仁塔娜

（青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001）

小鼠是生命科學(xué)研究最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選。長(zhǎng)骨和骨髓細(xì)胞研究是無數(shù)研究學(xué)科的中心，包括但不限于骨生物學(xué)、癌癥生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)和生物力學(xué)，其中，小鼠骨髓細(xì)胞在免疫、造血系統(tǒng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要［1-2］。尋求一種高骨髓細(xì)胞回收率的標(biāo)準(zhǔn)化骨髓分離方法對(duì)于流式活細(xì)胞分選、定量PCR及骨髓細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)是非常重要的。目前，原代小鼠骨髓細(xì)胞提取主要是在取出小鼠股骨、脛骨后，利用1 ml 注射器或26G 針頭吸取相關(guān)培養(yǎng)基再將骨髓細(xì)胞沖洗到15 ml 無菌離心管中，本研究所用的嵌套EP管法，能更快速地獲取更多的小鼠骨髓細(xì)胞［3-4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 雄 性SPF 級(jí)C57/BL6 小 鼠，6～8周齡，18～20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證：SCKK（京）2020-0004，質(zhì)量合格證：110322200101810883。飼養(yǎng)于青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心動(dòng)物房屏障環(huán)境中。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫恒濕，光照黑暗交替12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（SL-2020091）。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞活性檢測(cè)Zombie AquaTMFixable Viability Kit 及紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Biolegend公司，RPMI1640 及胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司；CCK-8購(gòu)自ELabscicence公司。

1.2 方法

1.2.1 嵌套EP管法獲取小鼠骨髓細(xì)胞 使用50 ml注射器針頭于500 μl EP管底部戳一圓形小孔，消毒后備用（圖1A）。麻醉后將小鼠仰面固定于一個(gè)消毒托盤上，心包取血/腹主動(dòng)脈放血處死小鼠。游離出小鼠雙下肢，剔盡小鼠雙下肢肌肉。分離雙側(cè)股骨、脛骨，將其浸入含75%乙醇的5 ml離心管中45 s，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)中，將股骨、脛骨移至含無菌PBS的5 ml離心管中。使用手術(shù)刀刮凈小鼠股骨、脛骨肌肉及結(jié)締組織，于股骨、脛骨一端切斷骨組織，暴露骨髓腔，將裸露骨髓腔部分向下置于準(zhǔn)備好的無菌帶洞500 μl EP 管中，蓋上管蓋，將其嵌套入含有100 μl培養(yǎng)基的1.5 ml EP 管中（圖1B），使用離心機(jī)高速離心10 s，獲得小鼠骨髓細(xì)胞（圖1C）。

圖1 嵌套EP管法獲取小鼠骨髓細(xì)胞Fig.1 Mouse bone marrow cells were obtained by nested EP tube

1.2.2 注射器沖洗法獲取小鼠骨髓細(xì)胞 同

1.2.1 方法獲得小鼠雙下肢后，剝離肌肉及結(jié)締組織，分離股骨、脛骨，分別剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔，取內(nèi)含PBS或培養(yǎng)基的1 ml注射器，將針頭輕輕插入骨髓腔，對(duì)準(zhǔn)一個(gè)無菌15 ml 離心管，反復(fù)沖洗將細(xì)胞沖出，1 500 r/min 離心5 min，即可獲取骨髓細(xì)胞［3-6］。

1.2.3 紅細(xì)胞裂解 兩種方法獲取骨髓細(xì)胞后，吸凈上清后加入2 ml 紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，室溫2 min，PBS洗2遍，該骨髓細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞活性測(cè)定 按上述方法得到小鼠骨髓細(xì)胞后，PBS洗2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取100 μl 細(xì)胞懸液，加入0.5 μl Zombie AquaTMFixable Viability Kit，室溫避光染色20 min，后使用含有5%FBS的PBS洗1遍，重懸于500 μl PBS中，BD AriaⅢ流式檢測(cè)活細(xì)胞比例。

1.2.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 按1.2.3 得到小鼠骨髓細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液接種于96 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，分別于接種細(xì)胞后12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 各孔加入10 μl CCK-8溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法獲取小鼠骨髓細(xì)胞的時(shí)間 取同一只小鼠，隨機(jī)選擇左右下肢分別用兩種方法處理。自小鼠麻醉開始至分離獲得小鼠雙下肢，嵌套EP 管法與注射器沖洗法步驟一致，所用時(shí)間一致。但自雙下肢離體后至最終獲得紅細(xì)胞裂解前的小鼠骨髓細(xì)胞兩種方法時(shí)間不同，嵌套EP管法所需時(shí)間更短（P<0.000 1），見表1。

表1 分離骨組織后至獲得含紅細(xì)胞骨髓細(xì)胞的時(shí)間Tab.1 Time between separation of bone tissue and acquisition of red blood cell-containing bone marrow cells

2.2 兩種方法獲取小鼠骨髓細(xì)胞的數(shù)量 EP管嵌套法暴露斷端后所留骨組織長(zhǎng)于注射器沖洗法，取得骨髓細(xì)胞后骨組織更為清亮（圖2）。獲取骨髓細(xì)胞紅細(xì)胞裂解后進(jìn)行計(jì)數(shù)，嵌套EP管法能獲得更多骨髓細(xì)胞（P=0.003），見表2。

表2 獲得的骨髓細(xì)胞數(shù)量（單側(cè)下肢，1×107個(gè)/ml）Tab.2 Number of bone marrow cells（unilateral lower limb，1×107/ml）

圖2 離心前后的骨組織Fig.2 Bone tissue before and after centrifugation

2.3 兩種方法獲取小鼠骨髓細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解后使用流式方法檢測(cè)活細(xì)胞比例，二者細(xì)胞分群一致，活細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.619 5），見表3。

表3 獲得的骨髓細(xì)胞的活細(xì)胞百分比（±s）Tab.3 Percentage of live cells in bone marrow cells （±s）

表3 獲得的骨髓細(xì)胞的活細(xì)胞百分比（±s）Tab.3 Percentage of live cells in bone marrow cells （±s）

Note：Compared with tube-nesting EP method group，1）P=0.619 5.

Percentage of live cells/（%）97.80±0.57 97.60±0.651）Groups Tube-nesting EP method Traditional syringe irrigation method

2.4 兩種方法獲取小鼠骨髓細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力 骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解后培養(yǎng)，二者細(xì)胞增殖趨勢(shì)相當(dāng)（圖3）。

3 討論

為了研究骨骼和骨髓在生理和病理?xiàng)l件下的多種作用，研究人員必須采用一種簡(jiǎn)單有效的標(biāo)準(zhǔn)化方法來解剖小鼠長(zhǎng)骨，以便進(jìn)行大量的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［1］。其中，小鼠骨髓細(xì)胞的提取是諸多科研實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)小鼠骨髓細(xì)胞的提取多為離心管沖洗法，PINEDA 等［8］利用兩個(gè)不同大小的移液器槍頭，去除尖端，嵌套后再次嵌套于1.5 ml EP 管中，利用離心的方法更快速獲取更多的骨髓細(xì)胞。本研究的嵌套EP管法，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，改良了獲取小鼠骨髓細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，明顯縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并能夠獲得更多的有活性的小鼠骨髓細(xì)胞。

注射器沖洗法更依賴操作者的雙手，如使用操作者的雙手來固定骨組織及注射器，不僅操作時(shí)間更長(zhǎng)，而且存在更多針刺傷的隱患，在增加醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)，更易造成細(xì)胞的污染，而嵌套EP 管法獲取小鼠骨髓細(xì)胞時(shí)，在分離小鼠獲得雙下肢后完全使用鑷子等器械，更不易污染細(xì)胞且減少了針刺傷的風(fēng)險(xiǎn)，利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行［7］。嵌套EP 管法中所使用的兩種規(guī)格的EP 管均為一般實(shí)驗(yàn)室的常用設(shè)備，前期準(zhǔn)備足夠多的帶洞的EP 管后可長(zhǎng)期使用，簡(jiǎn)單易行。

重要的是，與離心管沖洗法相比，嵌套EP 管法顯著提高了骨髓細(xì)胞獲得率，而不影響細(xì)胞活力，非常適合骨髓細(xì)胞的原代和體外培養(yǎng)的研究，特別是那些需要高細(xì)胞數(shù)量的實(shí)驗(yàn)。HEIB 等［9］研究也使用類似的方法，但所用的離心機(jī)更大，離心時(shí)間為1 min，而本研究使用的桌面離心機(jī)更為便捷且所占空間更小，同時(shí)離心時(shí)間更短，進(jìn)一步縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

目前該嵌套EP管法適用于小鼠，因其體型的特點(diǎn)，其下肢骨可以置于500 μl EP 管內(nèi)，暫不適用大鼠實(shí)驗(yàn)，大鼠的下肢骨較小鼠的長(zhǎng)且更為堅(jiān)實(shí)，且骨髓細(xì)胞含量豐富，使用傳統(tǒng)注射器沖洗法亦簡(jiǎn)便可行。

綜上所述，本研究的嵌套EP 管法，使用材料易于獲取，操作簡(jiǎn)單可行，能夠更快速獲得更多的小鼠骨髓細(xì)胞，減少了實(shí)驗(yàn)成本與動(dòng)物消耗，且減少了細(xì)胞污染及針刺傷的風(fēng)險(xiǎn)，適合推廣使用。