CD4+T 細胞在流感病毒感染誘發細胞因子風暴及急性肺損傷中的研究進展①

黃家望 馬心悅 朱夢晨 劉薇蓉 陳雨露 李 玲 （湖南中醫藥大學中西醫結合學院，長沙410208）

流感病毒是引起上呼吸道和下呼吸道感染的主要原因，對全球健康構成持續威脅。當前預防和治療流感的策略主要為每年接種疫苗和使用抗病毒藥物，然而，由于抗原轉移和漂移導致流感病毒表面抗原頻繁變化，使得流感病毒在接種疫苗后逃避抗體介導的免疫。抗病毒治療一般只在流感感染早期的短時間段內有效，而且許多流行的流感病毒株已經對目前的抗病毒藥物產生了耐藥性［1］。因此，迫切需要了解流感病毒感染的病理生理學以及機體的保護性免疫反應應答機制，以開發未來的預防和治療手段。

機體抵抗流感病毒感染及從流感病毒感染中恢復需要CD4+T 和CD8+T 細胞的作用。CD4+T 細胞通過幫助CD8+T 和B 細胞反應促進病毒清除來參與抗病毒免疫反應，是適應性免疫反應的關鍵參與者，在流感病毒感染誘發的急性肺損傷中扮演關鍵角色［2］。本文在現有研究及文獻調研的基礎上，就CD4+T 細胞在流感病毒感染誘發的細胞因子風暴及急性肺損傷中的影響進行重點闡述，并總結提出了此研究領域的現有挑戰及前景展望。

1 流感病毒誘發細胞因子風暴的機制

甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染引起的呼吸道傳染病是影響全球健康最大的潛在威脅，與僅在人類中發現的乙型流感病毒不同，當出現新的亞型（通常來自動物）時，IAV 會引起全球大流行［3］。在全球范圍內，每年有流感病毒300～500 萬例住院病例和25～50 萬例病死病例［4-5］。僅在20 世紀，就記錄了4 次流感大流行，最嚴重的“西班牙流感”，在1918～1919 年間席卷各大洲，影響了5 億人，造成超過3 000萬人病死［6］。近年來，針對流感病毒神經氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗流感藥物已被用于預防和治療流感病毒感染，但NA 中的某些氨基酸變化會產生耐藥IAV 毒株［7-8］。由于耐藥病例的增加，從而降低了當前治療的療效。

1.1 流感病毒在宿主內誘發細胞因子風暴的機制 在對抗流感病毒感染中，人類先天免疫系統起著至關重要的作用。一旦先天免疫系統檢測到病毒RNA，就會啟動一個快速的抗病毒信號級聯反應，導致受感染的上皮細胞和先天免疫細胞產生各種細胞因子［9］。流感病毒RNA 在病毒感染宿主后會在宿主細胞核內復制其片段化的基因組，因此，描述病毒復制所涉及的主要分子步驟在細胞水平上更好地理解流感病毒導致細胞因子風暴發病機制至關重要［10］。流感病毒的復制循環始于血凝素（hemagglutinin，HA）與唾液酸的結合，這會觸發網格蛋白介導的胞吞作用進入宿主細胞。M2 離子通道使內體的酸化觸發了HA 介導的融合過程和病毒核糖核衣殼的釋放，這使得負責從M1 蛋白釋放病毒核糖核蛋白（Viral ribonucleoprotein，vRNP）復合物的病毒核心酸化，vRNP 可以通過使用輸入蛋白-α/輸入蛋白-β 兩種核輸入途徑自由遷移到細胞核中［11］。進入細胞核后，所有基因組片段都被轉錄（其中兩個被宿主細胞機器剪接），由RNA 依賴的RNA 聚合酶加帽和聚腺苷酸化，用于病毒蛋白質合成細胞質階段。同時，RNA依賴的RNA聚合酶復合物與衣殼化RNA 段的前導序列結合并合成完整的互補反基因組，這將進一步用于形成新RNA 基因組片段的模板［12-13］。病毒酶在基因組復制階段傳遞所有RNA 片段的轉錄信號。細胞質中產生的病毒核糖核復合體的結構蛋白和非結構蛋白都重新進入細胞核并組裝。高水平的流感病毒M1 蛋白刺激核輸出蛋白介導的新合成病毒基因組片段轉移回細胞質［13］。vRNP 的核輸出通道是肺細胞產生感染的另一個關鍵步驟，它也依賴于病毒誘導的受感染細胞中活性氧（reactive oxygen，ROS）的增加［14］。在組裝階段，核糖核衣殼與HA、NA 相互作用，在M2 介導的膜去極化后，病毒開始出芽，隨后是NA 介導的病毒釋放［15］。病毒出芽釋放后，單核細胞/巨噬細胞大量浸潤到肺中，引起的肺炎會引起大量炎癥肺損傷及肺部炎癥反應，進而引發“細胞因子風暴”［16］。

1.2 宿主免疫系統在流感病毒誘發的細胞因子風暴中的作用機制 在流感病毒RNA 這個復制周期中，宿主防御機制不僅僅是一個被動的旁觀者，許多病原體識別受體（pathogen recognition receptor，PRR）可以將病毒RNA 識別為病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），從而促進下游細胞和體液免疫反應，產生大量細胞因子，即“細胞因子風暴”［17］。流感病毒內化到上下呼吸道上皮細胞后，可以被先天免疫傳感器檢測到并觸發下游免疫反應過程，產生大量細胞因子。在病毒感染的細胞中直接誘導產生的細胞因子被稱為主要細胞因子，在主要細胞因子中，病毒感染的肺上皮、內皮和其他免疫細胞產生Ⅰ型和Ⅲ型干擾素、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-33 等細胞因子，主要是限制病毒復制和傳播并啟動下游免疫反應。在被原發細胞因子、CD8+T 細胞、NK 細胞、ILC2s、Tregs 和Th2 細胞招募和激活后，可以分泌次要細胞因子IFN-γ、IL-10、雙調蛋白（amphiregulin，AREG）和IL-5 來消除病毒和病毒感染細胞，抑制炎癥并恢復肺功能［18］。在免疫反應的適應性階段，不同的T細胞亞群被激活和調節以分泌促進病毒清除、組織穩態和肺修復的次級細胞因子。正如1918 年流感大流行期間觀察到的病例中描述的那樣，原發性病毒性肺炎的肺損傷主要是由于炎癥細胞因子的過度產生，但這些細胞因子主要是由肺細胞中的病毒復制有效觸發Ⅱ型肺泡細胞、肺巨噬細胞，或在某些情況下由內皮細胞激活釋放［19-20］。在這種情況下，活化的巨噬細胞和受感染的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）都進一步引發了大量的免疫反應和“細胞因子風暴”［21-22］。研究發現，嚴重的細胞因子釋放可循環至全身并導致全身細胞因子風暴，這可能不僅導致急性肺損傷，甚至導致多個器官功能障礙［23］。

以上既往研究表明，流感病毒誘發過激免疫反應介導的“細胞因子風暴”過度釋放多種細胞因子（圖1），進而引發的急性肺損傷是嚴重季節性大流行的流感病毒與高致病性禽流感病毒的臨床重癥病例甚至病死的重要原因。

圖1 流感病毒誘發細胞因子風暴機制Fig.1 Cytokine storm mechanism induced by influenza virus

2 CD4+T 細胞在流感病毒誘發細胞因子風暴與急性肺損傷的機制研究

2.1 CD4+T 細胞在流感病毒誘導的急性肺損傷中的作用機制 流感病毒是一種主要侵襲人上呼吸道和下呼吸道上皮細胞的呼吸道感染性病原體［24］。流感病毒感染有可能在受感染的宿主中引起過度的肺部炎癥和大量的組織損傷。近年來的研究表明，肺效應T 細胞和抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）之間的局部相互作用在指導效應T 細胞的積累、分化和功能方面發揮關鍵作用［25］。傳統的CD4+T 細胞和CD8+T 細胞以及非常規的先天性T細胞對感染做出反應，并為清除病毒感染細胞和解決肺部炎癥和損傷做出重要貢獻。

與僅限于對病毒感染細胞進行細胞毒性殺傷的CD8+T 細胞相比，CD4+T 細胞在對感染的反應中發揮更加多樣化的作用。CD4+T 細胞通過產生細胞因子，將免疫系統的其他細胞募集到感染部位，以幫助應對病原體，以及為B 細胞和CD8+T 細胞提供幫助來協調適應性免疫反應［26-27］。對于抗原識別，CD4+T 細胞依賴于與APC 的相互作用，APC 以與MHCⅡ類分子結合的短線性肽的形式吸收、處理和呈遞抗原［28］。另一方面，CD4+T 細胞通過介導流感病毒感染細胞的細胞溶解直接發揮效應功能，流感病毒感染后，病毒特異性CD4+T 細胞作為長壽命記憶細胞群可以維持對病原體特異性抗體的刺激作用，具有增強的防止繼發感染的能力，當再次遇到抗原時能做出更迅速和更強烈的反應［29］。研究發現，在流感感染的小鼠模型中，記憶CD4+T細胞已被證明可以獨立于B 細胞和CD8+T 細胞介導的保護性反應之外［30］。除了幫助CD8+T 細胞和B 細胞發揮作用外，CD4+T 細胞還表現出抗流感病毒感染的直接效應活性，近期研究發現，肺部CD4+T細胞表達細胞溶解分子，如顆粒酶B（Gzmb）和穿孔素，并表現出對流感病毒感染細胞的直接細胞毒性，同時，流感特異性CD4+T 細胞中Gzmb 和穿孔素表達的上調僅限于感染部位，表明肺部炎癥微環境促進了這些細胞毒性CD4+T細胞的產生［31］。

綜上所述，CD4+T 細胞對流感病毒感染引起的肺部炎癥及肺損傷有顯著影響，CD4+T 細胞作為免疫系統的關鍵組成部分，通過產生大量細胞因子及協調其他免疫細胞和非免疫細胞的作用，在整個生命中防御流感病毒感染等方面發揮關鍵作用。

2.2 CD4+T 細胞在細胞因子風暴發生進展中的作用機制研究 胸腺支持T細胞是從骨髓造血干細胞分化的T 祖細胞發育而來，并選擇成熟的CD4+T淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞［32］。定量估計表明，健康成年人用大約2.2×1011個成熟的CD4+T 細胞，其中大多數存在于外周淋巴器官中，通過抗原提呈細胞的協調作用幫助B 細胞和CD8+T 細胞發生免疫應答反應［27，33］。CD4+T 細胞的數量在人體內包括IL-7在內的機體穩態機制保持恒定［32］。但由于細胞死亡、半衰期縮短或產生受損，總CD4+T細胞可能會耗盡。此外，循環CD4+T 細胞的比例可能會通過炎癥部位的淋巴組織重新分布而減少［34］。據報道，某些新型冠狀病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）患者發展至細胞因子風暴時，其免疫組化結果顯示，脾臟和淋巴結中包括CD4 和CD8 亞型在內的T淋巴細胞數量遠低于正常值，此外，患者體內單核細胞和巨噬細胞增加，這就解釋了促炎細胞因子水平升高的現象［35］。

CD4+T 細胞受到抗原刺激后，可分化成Th1、Th2 和Th17 細胞等不同亞型，其中Th1 細胞調節巨噬細胞的募集，Th2 細胞募集嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，Th17 細胞募集中性粒細胞［36］。Th1 細胞產生大量干擾素-γ，誘導遲發性超敏反應，激活巨噬細胞，并且對于防御細胞內病原體至關重要。Th2細胞分泌大量IL-4、IL-5 等細胞因子，參與體液免疫應答。Th17 細胞分泌IL-6 和IL-17，參與炎癥反應和自身免疫性疾病［37-38］。具有不同細胞功能的CD4+T 細胞亞型，是在病原體刺激下分化而成，并釋放大量細胞因子，這類細胞因子在細胞因子風暴中水平升高，在細胞因子風暴中發揮重要作用［39］。

綜上所述，CD4+T 細胞在機體細胞因子風暴中起關鍵作用，CD4+T 細胞受到病原體刺激后在體內不同條件下分化形成具有不同細胞功能的亞型，分泌大量細胞因子，在機體抗病原體感染方面發揮著重要作用。

2.3 CD4+T 細胞在流感病毒誘發細胞因子風暴與急性肺損傷的機制研究 IAV 感染可以引起中重度急性呼吸道疾病，并且是全球發病率和病死率的重要原因［40］。研究表明，CD4+T 和CD8+T 細胞在對流感的適應性免疫反應中發揮著重要作用，肺效應CD4+和CD8+T細胞利用多種效應和調節機制來消除病毒感染的細胞，并調控肺部的炎癥和損傷［25］。

細胞因子風暴涵蓋了多種免疫失調疾病，其特征是全身癥狀、全身炎癥和多器官功能障礙，如治療不當，可導致多器官功能衰竭。細胞因子風暴的發生和持續時間因病因和治療方法不同，但細胞因子風暴的晚期臨床表現會趨同并且經常重疊［41］。幾乎所有的細胞因子風暴患者都會發熱，嚴重的可能是高燒，此外，患者可能有疲勞、厭食、頭痛、皮疹、腹瀉、關節痛、肌痛和神經精神癥狀，這些癥狀可能直接由細胞因子誘導的組織損傷或急性期生理變化引起，也可能由免疫細胞介導的反應引起［42］。許多患者有呼吸系統癥狀，包括咳嗽和呼吸急促，可發展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），伴有低氧血癥，甚至可能需要機械通氣［43］。在固有免疫反應最初的逃逸之后，流感病毒的識別促進肺DC 遷移到淋巴結，將抗原呈遞給經過的T 細胞，從而形成更強大的抗原特異性T 細胞和B 細胞產生適應性反應。在此反應期間，可溶性介質通過與靶細胞表面的特定受體結合，在細胞功能和信號轉導中發揮作用，CD8+T 細胞產生過量的TNF-α 和IFN-γ，導致直接組織損傷，而活化的CD4+T細胞，在TGF-β和IL-6作用下，分化為Th17-細胞亞群，對消除細胞外病原體和保護自身免疫起重要作用，它們主要靶向巨噬細胞、DC、內皮細胞和成纖維細胞，以增加IL-1、IL-6 和TNF-α 的產生［44-45］。在細胞因子風暴綜合征的情況下，CD4+T細胞的過度激活以及細胞因子和趨化因子的產生會在組織水平產生不受控制的過度炎癥損傷，導致局部和遠處損傷［46］。研究發現，炎癥增加與外周血淋巴細胞減少、淋巴細胞與中性粒細胞比率顯著下降以及CD4+T細胞功能障礙有關［47］。

綜上所述，可以推測，流感病毒感染人體時，主要侵入上下呼吸道上皮細胞，肺部抗原識別細胞識別病原體時，將抗原提呈至T 細胞，刺激T 細胞成熟，成熟T 細胞中CD4+T 細胞識別由MHCⅡ類分子提呈的抗原肽，產生大量細胞因子，形成“細胞因子風暴”，進而造成急性肺損傷，重者甚至造成ARDS。

3 現有挑戰及前景展望

本文通過對CD4+T細胞、細胞因子風暴、流感病毒及其引起的急性肺損傷的相關文獻進行分析，明確了流感病毒感染會激活CD4+T 細胞，刺激其產生大量細胞因子，導致過激的免疫反應和免疫失調，即“細胞因子風暴”，進而引發急性肺損傷，甚至ARDS。基于現有研究，本文從兩個方面闡述CD4+T 細胞在研究新型有效抗流感病毒及治療其引起的急性肺損傷方法的現有挑戰：①抗病毒藥物對病毒后代施加選擇壓力，促進其突變和選擇，從而使病毒產生耐受性；其次，與包括流感在內的急性病毒性呼吸道疾病相關的急性肺損傷是病毒在其感染的裂解細胞中的內在毒力和可能損害組織并促進細胞因子風暴的免疫反應強度相結合的結果，因此，研發既對病毒有效，同時對細胞因子風暴或免疫介導的損傷能有效緩解的抗病毒藥物是一大挑戰［48］；②細胞因子風暴是一種讓免疫系統短時間內火力全開的一種求助信號，雖然能夠損傷病毒，但也會給機體本身留下許多連帶傷害，如何從免疫調控的角度，調控細胞因子風暴發生發展有待進一步研究闡明［49］。

本文通過大量文獻分析，對細胞在研究新型有效抗流感病毒及治療其引起的急性肺損傷方法總結出以下兩點展望：①現有研究說明了流感病毒感染引發機體免疫反應時，CD4+T 細胞受到病原體刺激活化，產生大量細胞因子，若能有效實時觀測CD4+T 細胞［39，45］，了解其在流感病毒感染及其引發的急性肺損傷中的完整作用機制并加以區分，CD4+T 細胞或可作為一種標志物以明確流感病毒感染程度并評價預后；②現有研究說明，中醫藥在抗病毒和調控細胞因子風暴的發生發展方面療效顯著［50-51］，DING 等［52］發現蓮花清瘟膠囊在抗流感病毒中起單獨抗病毒作用，可協同西藥抗病毒；YANG等［53］發現清肺排毒湯通過調節TLR4-NF-κB 信號通路，抑制細胞因子的釋放，從而調控細胞因子風暴的進展，進而減輕肺部炎癥損傷，因此，是否能借鑒中醫“扶正祛邪”“未病先防”理論，運用中醫藥早期干預的顯著療效，既可有效抗病毒，又能調控細胞因子風暴發生發展。