脂多糖減量合成對細胞外膜功能的影響

李婧芳,韓夢圓,李銘心,張濛,田康明

(天津科技大學 化工與材料學院,天津,300457)

細胞個體維持相對懸浮狀態有利于營養物質、底物和產物的傳遞。細胞個體實現相對懸浮的物質基礎是細胞外膜及其主要結構組成成分。大腸桿菌細胞外膜是由磷脂、脂多糖及外膜蛋白共同構成的高度不對稱的脂質雙分子層。外膜蛋白(outer membrane proteins,Omps)包括參與營養物質運輸的微孔蛋白、維持細胞完整性的脂蛋白以及與細菌生長相關的微量蛋白。其中OmpC、OmpF和PhoE是大腸桿菌最重要的外膜孔蛋白,與脂多糖合成密切相關,并受脂多糖合成的影響[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),包括O-抗原、核心多糖和脂質A[2-3],起到維持細胞膜完整性的作用[4]。其中脂質A結構域是一種獨特的氨基葡萄糖基磷脂,作為LPS的疏水錨,是脂多糖中的生物活性中心。脂質A結構在各種細菌中相對保守,但它的結構會隨著環境的變化而改變[5-6],結構的變化引起細胞外表面發生改變。現有的研究結果表明,脂質A結構的改造包括去除或修飾脂質A磷酸鹽脂酰基鏈[7],可以通過破壞相關合成酶的結構基因和引入生物合成基因來進行人工修飾[8],實現對脂質A結構的定向改造進而改變大腸桿菌外膜的特性。有研究者提出敲除部分脂多糖合成相關基因,同時定點突變脂多糖轉運蛋白編碼基因以降低其底物特異性,可減少脂多糖的含量[9-11]。該研究結果為探索脂多糖減量合成對細胞外膜功能的影響奠定了基礎。

細胞自凝集作為細胞外膜功能改變后的主要群體表現形式之一,是指同種細菌或不同種細菌之間在自凝集素的介導或自然條件下,相互識別而聚集形成一種絮凝狀態[12-13]。在宏觀上表現為靜態菌懸液中菌體的沉降,在培養容器底端形成菌體沉淀。自凝集素包括作為細胞表面結構的蛋白質[14]和胞外多糖[15]以及非細胞結構的其他物質,如鈣離子、鎂離子[14]等。自凝集現象發生的機制有兩類,一類是由表面靜電效應引起的菌體聚集,包括菌體在水溶液中的疏水表面特性或表面帶電的細菌細胞在帶相反電荷的凝集素存在下發生的聚集;另一類是由菌體表面蛋白之間相互作用介導的聚集,這些蛋白均含有β-螺旋結構,使親水的氨基酸殘基暴露在外側,增強蛋白質分子間的相互作用。例如細胞外膜蛋白種類或數量改變后介導細菌附著在無機材料表面,可以形成一層生物膜[16-17]。在工業生產中,菌體細胞自凝集對于實現菌體細胞的可控沉降具有顯著的指導意義,并作為發酵生產結束后菌體去除的一種方法,提高發酵后期菌體的分離效率,進而降低工業產品的精制成本[18-19]。

在大多數情況下,細菌的自凝集是由表面蛋白質間的相互作用所介導的[14]。細胞外膜中的表面蛋白通常附著于脂多糖的空間間隙中。改變脂多糖的合成水平,有可能影響細胞外膜相關表面蛋白的表達水平、種類和數量,對細菌的自凝集產生一定的影響。基于此,本研究以大腸桿菌為研究對象,利用Red重組系統對部分脂多糖合成相關基因進行刪除,選育脂多糖減量合成菌株,進一步探究脂多糖合成量的減少對大腸桿菌細胞結構、生長性能、外膜功能特性和自凝集特性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株見表1。

1.2 引物序列

本研究所用引物見表2,均合成自上海生工有限公司。

表2 本研究所用到的引物Table 2 Sequence of oligonucleotide primers for the construction of recombinant strains

1.3 試劑與培養基

酵母提取物、蛋白胨,Oxoid公司;苯酚,Solarbio公司;常規化學品非注明均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

LB培養基[21](g/L):酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10,固體培養基需另外補加18 g/L的瓊脂粉;

微量元素母液(g/L):FeCl3·6H2O 2.4,CoCl2·6H2O 0.3,CuCl2·2H2O 0.15,ZnCl20.3,Na2MO4·2H2O 0.3,H3BO30.075,MnCl2·4H2O 0.495,115 ℃滅菌20 min備用。

M9培養基[21](g/L):NaCl 0.5、NH4Cl 1、KH2PO43、Na2HPO4·12H2O 15.1,接種前加入1 g/L的MgSO4(1 mol/L)和微量元素,按需添加葡萄糖。

1.4 儀器與設備

5 L離位磁力攪拌發酵罐,上海保興公司;UV-1200紫外分光光度計,上海美普達公司;SBA-40X生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所。

1.5 實驗方法

1.5.1 重組菌株構建

重組菌株構建按照實驗室常規分子操作方法[22]進行。基因刪除的順序如下:msbA、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA和lpxM;按照實驗理論設計,各突變盒條帶對應大小分別為5.2、2.0、2.0、2.1、2.0、2.0、1.8 kb;基因刪除前對應野生型條帶大小分別為2.0、2.1、1.6、1.3、1.6、1.5、1.0 kb;完成基因刪除后,對應突變型條帶大小分別為4.2、1.4、1.0、1.0、1.2、1.1、0.8 kb。

1.5.2 細胞干重及脂多糖含量測定

在單位OD600下對菌體干重和脂多糖含量進行測定。其中菌體細胞干重采用烘干法,脂多糖提取方法參照改良后的熱酚水解法[23]進行。

1.5.3 細胞外膜滲透性及表面疏水性測定

細胞外膜滲透性及表面疏水性測定參照HELANDER等[24]和DEL等[25]的方法。

外膜滲透性測定:依照初始OD600=0.02轉接到LB液體培養基中,37 ℃,200 r/min恒溫培養,用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將收集到的菌體洗滌、打散混勻后,得到OD600值為0.5的菌懸液。在石英比色皿中加入1 920 μL菌懸液和80 μL濃度為10 μmol/L的N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)溶液,吹吸混勻,設置參數:激發波長350 nm、發射波長428 nm,縫寬5 mm,讀取各樣本穩定后的數值。每個樣本設置3個平行樣本。

表面疏水性測定:從固體平板挑取單菌落轉接至LB液體培養基(50 mL/250 mL)過夜培養,取菌液控制初始OD600=0.2,轉接到新的LB培養基中,37 ℃培養至OD600=2.0。6 000×g離心10 min,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)將收集的菌體洗滌沉淀2次并重懸,得到菌懸液OD600=1.0。取5 mL菌懸液置于試管中,并加入2 mL的二甲苯溶液,充分振蕩混勻120 s,常溫下垂直靜置30 min,取下相液體測定600 nm處吸光度。每個樣品設置3個平行。根據二甲苯添加前后的菌液吸光度差異,計算細胞疏水性,如公式(1)所示:

(1)

式中:A1為添加二甲苯前OD600值,A2為添加二甲苯后下層液體OD600值。

1.5.4 細菌自凝集特性測定

菌體細胞自凝集率測定參照ROUX等[26]的方法。按照初始OD600=0.02,將菌液轉接至LB培養基中,37 ℃, 200 r/min培養12 h。2 656×g離心10 min收集菌體,用磷酸鹽緩沖液洗菌體兩次,并重懸菌體控制OD600=2.5。取5 mL重懸液于玻璃試管中,在4 ℃靜置48 h,測定液面下1 cm處的菌液濃度,每個樣品設3個平行,計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A3為自凝集前OD600值,A4為自凝集后上層菌液OD600值。

2 結果與分析

2.1 脂多糖減量合成菌株的構建

以實驗室保藏菌株E.coliLG101為出發菌株,按照1.5.1節方法,對脂多糖轉運蛋白MsbA的148位堿基C定點突變為T,在此基礎上完成脂多糖合成及結構修飾的相關基因的疊加刪除,并完成重組菌株的構建,依次命名為LGL4A01～LGL4A06。

在篩選得到已完成脂多糖轉運蛋白編碼基因msbA的定點表達菌株的基礎上,根據圖1所示的電泳結果可知,突變型和野生型條帶大小與1.5.1節中理論條帶大小一致,可以得出已成功刪除1.5.1節中全部的脂多糖合成關鍵基因并構建重組菌株,命名為LGL4A06,用于后續研究。

2.2 菌體及脂多糖合成量評價

由2.1節結果可知,菌株LGL4A06關于脂多糖合成及結構修飾的基因型已發生變化。進一步在搖瓶培養條件下,測定出發菌株和重組菌株LGL4A06菌株脂多糖含量和菌體細胞干重(圖2)。結果顯示,與出發菌株LG101相比,菌株LGL4A06的脂多糖含量和細胞干重均有所下降,單位OD600菌體干重下降了32.46%(12 018.72 μg / 8 116.78 μg),脂多糖含量下降了39.34%(1 389.73 μg/842.97 μg),根據脂多糖的減少量可以得出影響脂多糖合成的關鍵基因是lpxM,且隨著部分脂多糖合成關鍵基因疊加刪除,單位OD600菌體干重和脂多糖含量整體呈遞減的趨勢,進一步證實上述重組菌的選育過程實現了脂多糖的減量合成。

1～7-lldD、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA,lpxM野生型對照;8～14-lldD、kdsD、lpxL、pagP、lpxP、eptA,lpxM突變型大小;M-1 kb gene ladder圖1 出發菌株和重組菌分子鑒定電泳圖譜Fig.1 Identification of mutant strains through colony PCR

a-單位OD600菌體干重;b-單位OD600脂多糖含量圖2 細胞單位OD600對應菌體干重及脂多糖含量Fig.2 Dry cell weight and lipopolysaccharide content of strains

2.3 細胞外膜滲透性及表面疏水性評價

有研究表明,脂多糖及外膜蛋白OmpF和OmpC影響細胞外膜滲透性[27],截短脂多糖結構或外膜蛋白缺失均可引起外膜滲透性變化;以此為依據,本研究評價脂多糖的減量合成對細胞外膜滲透性和表面疏水性的影響,進而通過二者前后的變化評價脂多糖的減量合成對細胞外膜功能的影響。

與出發菌株LG101相比,脂多糖減量合成菌株LGL4A06的外膜滲透性如圖3結果顯示,提高了55.05%(721.93/465.60)。菌株LGL4A06的細胞表面疏水性相較于菌株LG101提高了5.81倍(34.34%/5.04%)。

a-外膜滲透性測定;b-細胞表面疏水性測定圖3 細胞外膜相關功能特性測定Fig.3 Determination of relevant function of the outer membrane

2.4 脂多糖減量合成對細胞自凝集效率的影響

2.4.1 菌體自凝集特性測定

在研究中發現,菌體改造后自凝速率相對于出發菌株有著明顯的變化,按1.5.4節方法測定二者自凝集性能差異性,結果如圖4所示,出發菌株LGL101和突變菌株LGL4A06在靜置72 h后,菌體自凝集率均達到80.00%以上,但是突變菌株耗時更短;改造后的菌株LGL4A06在靜置12 h時,菌體自凝集率為83.20%,此時,出發菌株自凝集率僅為6.00%;細胞表面疏水性增強可提高細胞間的相互作用力[12],由2.2節結果顯示脂多糖減量合成導致菌株LGL4A06疏水性較出發菌株提高了5.81倍,因此進一步提高了菌株自凝集率。

在本研究中發現,菌體改造后自凝速率相對于出發菌株有著明顯的變化,按1.5.4節方法測定二者自凝集差異性。結果如圖5所示,出發菌株LGL101自凝集率均低于突變菌株LGL4A06,LG101自凝集率約為5.00%,LGL4A06自凝集率在80.00%以上;同一菌株自凝集率不受環境因素的影響,這一結果與王洲等[17,23]的研究結果一致。

圖5 不同溫度對LGL4A06菌株和出發菌株菌體 細胞自凝集性能的影響Fig.5 The auto-aggregation ratio of LG101 and LGL4A06 at different temperature

2.4.2 鈣離子、鎂離子對菌體自凝集特性的影響

如圖6所示,添加鈣離子、鎂離子對出發菌株LG101自凝集特性無影響,但可有效提高突變菌株LGL4A06自凝集速率。重組菌株LGL4A06添加10 mmol/L鈣離子后靜置4 h,自凝集率即達到95.00%,添加10 mmol/L鎂離子的重組菌株自凝集率為83.00%,未額外添加金屬離子的突變菌株自凝集率為22.00%,出發菌株自凝集率僅為(6.50±0.50)%;添加鈣離子、鎂離子的突變菌株在靜置5 h后,自凝集率均達到最大(鈣離子:97.00%;鎂離子:88.00%)。出現這一結果的可能原因是脂多糖減量合成導致鑲嵌于外膜的蛋白質含量減少,增加了糖脂磷酸基團與二價陽離子的結合,形成靜電吸引,加速菌體沉降[14]。

a-鈣鎂離子對菌株自凝集性能影響折線圖; b-鈣鎂離子添加后各菌株靜置4 h狀態圖圖6 鈣鎂離子對菌株LGL4A06和出發菌株LG101菌體 細胞自凝集性能的影響Fig.6 Effect of divalent cation on auto aggregation of LG101 and LGL4A06

3 結論與討論

脂多糖結構變化可影響菌體自凝集特性,具體表現為脂多糖結構簡化提高菌株自凝集率,12 h內脂多糖減量合成菌株自凝集率較出發菌株提高了13.9倍;菌株的自凝集速率不受環境溫度的影響;外加鈣離子、鎂離子可顯著提高菌株自凝集率,可將自凝集進程縮短至5 h。同時,簡化脂多糖結構可降低脂多糖含量,在發酵生產過程中,能夠將用于形成細胞結構的碳源更多地流向產物形成,進一步提高底物到產物的轉化率,降低生產成本。自凝集在工業上的應用價值主要是發酵后期菌體與產物的分離,提高菌體自凝集效率可簡化產品精制步驟,有效降低生產成本。