納米-氧化鎂荷正電無機陶瓷膜的制備及對葡萄汁中赭曲霉毒素A的靜電吸附

南米娜,辛雪燕,薛華麗*

1(甘肅農業大學,實驗室與基地管理中心,甘肅 蘭州,730070) 2(甘肅農業大學 理學院,甘肅 蘭州,730070)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是低分子質量真菌次級代謝產物,在谷物、葡萄、可可、咖啡豆及其加工產品中均被檢測發現[1]。OTA具有多種毒性作用,包括腎毒性、肝毒性、神經毒性和免疫毒性,被國際癌癥研究機構劃分為能夠導致人類和動物患癌的ⅡB類致癌物[2]。作為一種弱有機酸,OTA結構中的羧基與羥基會發生解離,在堿性、中性及弱酸性條件下OTA多帶有負電(OTA-,OTA2-)[3]。雖然OTA物理化學性質穩定,很難通過高溫加熱等傳統的食品加工與生產途徑將其消除[4]。但是利用OTA的電負性,采用帶正電吸附劑以靜電相互作用脫除OTA,為解決真菌毒素的消除困難提供了新的思路和方法。

葡萄在采前與采后均易受到青霉屬與曲霉屬真菌侵染,并在生長過程中產生并積累OTA毒素。葡萄漿果的污染直接導致葡萄汁中的OTA曝露,但是不同葡萄果汁中OTA的污染存在差異,紅葡萄果汁中較為嚴重,而白葡萄汁檢出率則相對較低。德國分析發現89%的紅葡萄汁中OTA含量超過10 ng/L,而白葡萄汁的比例為81%(OTA>10 ng/L)[5]。有研究檢測發現中國葡萄汁陽性率高達100%,伊朗檢測樣本中OTA污染水平達到了55.7%[6-7]。此外,評估計算發現全球葡萄汁中OTA流行率為36%,因此葡萄汁中OTA的消除成為了該產業亟待解決的問題[8]。

無機陶瓷基膜具有價格低廉、耐高溫、耐酸堿、機械強度高、易再生、安全等優點,廣泛應用于飲用水凈化、醫藥、牛奶除菌等領域[8]。當荷電材料覆蓋在無機陶瓷膜的表面與孔徑內時,可獲得與基膜帶有不同荷電性質的無機陶瓷膜[9]。荷電無機陶瓷膜因帶有電荷,除了能夠以物理截留的方式分離組分外,還可以利用靜電吸附作用來分離細菌、病毒、小分子染料等粒徑較小且帶有相反電荷的微粒,如四環素、有機染料等[10]。截至目前,荷電無機陶瓷膜在污水處理領域被廣泛研究,而利用該材料消除食品中真菌毒素尚未見報道。傳統的真菌毒素物理脫除材料單一,主要包括活性炭、膨潤土和殼聚糖等,這些材料一般通過較大的比表面積和較小的孔徑來物理截留真菌毒素[1]。而真菌毒素大多為小分子化合物,很難利用物理篩分進行去除。此外,物理吸附劑的截留作用在去除毒素的同時,會對食品中大分子營養物質造成損失。相較傳統的物理吸附材料,荷電無機陶瓷膜可利用靜電作用選擇性吸附食品中真菌毒素,且陶瓷膜較大的孔徑能有效避免吸附劑對食品營養品質及風味的影響,可作為新型、高效的真菌毒素的脫除劑來使用。

本文首次提出了一種利用納米-氧化鎂(nano-MgO)荷正電無機陶瓷膜與帶負電OTA間的靜電吸附作用來去除葡萄汁中OTA的新方法。采用荷正電納米材料對無機陶瓷膜進行改性,利用聚乙二醇作為分散劑來提高無機陶瓷膜表面納米材料的覆蓋度。以荷正電無機陶瓷膜作為OTA脫除部件,通過改變蠕動泵的流速、溶液的pH、溶液的溫度等來確定MgO荷正電膜脫除OTA的最佳條件,應用于葡萄汁中OTA的脫除,并對葡萄汁的品質和香氣變化進行分析。nano-MgO荷正電無機陶瓷膜能夠靜電脫除食品中帶負電的真菌毒素,提供了一種真菌毒素物理脫除的新材料與新方法。荷電無機陶瓷膜價格低廉、使用簡單、安全可靠,將無機陶瓷膜修飾不同的荷電材料,還可延伸至其他真菌毒素的脫除。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無機陶瓷基膜,廣州凈易高科技股份有限公司;尿素,煙臺市雙雙化工有限公司;硝酸,天津市標準科技有限公司;MgCl2·6H2O,天津市凱通化學主要試劑有限公司;聚乙二醇6000(polyethylene glycol,PEG),天津市大茂化學主要試劑廠;OTA,青島普瑞邦生物工程有限公司;以上試劑均為分析純;甲醇、乙腈,均為色譜純,成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

TECNAIG2透射電子顯微鏡,FEI公司;KSL-1400X馬弗爐,合肥科晶材料技術有限公司;ZEN3600納米粒度儀,馬爾文公司;265079氣相色譜-質譜聯用儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;JEOL-5600LV掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社;DS-2510超聲波清洗儀,上海奧譜勒儀器有限公司;LC-20A高效液相色譜儀串聯RF-20A熒光檢測器,日本島津;MFC229多功能固相凈化柱,青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 nano-MgO荷正電無機陶瓷的制備

無機陶瓷打磨加工為直徑2 cm、厚3 mm、2.0 g的基膜,然后在2 mol/L HNO3溶液中浸泡8 h,去離子水超聲清洗30 min后,100 ℃下烘干處理,重復上述步驟3次[11]。

MgCl2·6H2O和尿素(摩爾質量之比為4∶1)分別溶于100 mL去離子水。將質量為MgCl2·6H2O 1.5%的PEG倒入圓底燒瓶,加入尿素溶液,并逐滴滴加MgCl2·6H2O溶液,于90 ℃反應5 h后獲得涂膜液。涂膜液加去離子水超聲清洗,靜置8 h后保留下層白色乳濁液備用。涂膜時先用去離子水超聲清洗涂膜液1 h,放入潔凈的無機陶瓷基膜超聲涂膜30 min,之后置于80 ℃的烘箱烘干,重復超聲涂膜3次后將修飾后的無機陶瓷基膜置于馬弗爐中,程序升溫燒制[11]。

1.3.2 形貌及結構表征

納米荷電無機膜表面微觀形貌及形態結構利用JEOL-5600LV型掃描電子顯微鏡進行觀察分析。nano-MgO的晶體形態采用透射電子顯微鏡進行測定觀察。

1.3.3 OTA脫除實驗裝置

OTA吸附裝置如圖1所示,核心組件為nano-MgO荷正電無機陶瓷膜,此外還設置有恒溫裝置,蠕動進樣裝置和溶液收集裝置,裝置接口均保持密封以防止溶液揮發。

圖1 OTA脫除裝置示意圖Fig.1 Schematic of OTA removing device

1.3.4 OTA吸附條件篩選

分別改變試驗中nano-MgO荷正電無機陶瓷膜質量,溶液pH值,溫度,蠕動泵流速中的一個因素,固定其他因素。將25 mL 20 μg/L的OTA溶液通過脫除裝置處理,收集濾液并測定其中OTA的含量。

nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對OTA吸附率的計算如公式(1)所示[12]:

(1)

式中:R為吸附率;C0為OTA初始質量濃度,ng/mL;Ce為荷電膜處理后OTA溶液的質量濃度,ng/mL。

1.3.5 OTA的分離與測定

處理后的葡萄汁于40 ℃蒸發濃縮至2 mL左右,采用MFC229多功能固相凈化柱對其中的OTA進行提取與分離,洗脫液濃縮吹干后用V(乙腈)∶V(水)=51∶49復溶并過濾,采用高效液相色譜-熒光進行分析。流動相同樣采用V(乙腈)∶V(水)=51∶49;每次進樣50 μL;流速設定為1 mL/min;柱溫為35 ℃;熒光檢測的激發與發射波長分別設定為333 nm與460 nm。

1.3.6 葡萄酒中OTA的脫除

空白基質(紅葡萄汁、紫葡萄汁)中加入OTA標準溶液,配制最終質量濃度分別為10、15、20 μg/L的OTA混合樣品,樣品于最佳條件通過nano-MgO荷正電無機陶瓷膜,收集OTA吸附處理后的樣品并測定OTA含量與品質變化。

1.3.7 葡萄酒的品質測定

還原糖采用3, 5-二硝基水楊酸法以蒸餾水為空白測定520 nm下的吸光度,根據標準曲線計算含量[13]。總酚采用Folin-Ciocalteu比色法測定波長760 nm下的吸光度[14]。采用旋轉黏度計測定黏度[15]。采用手持阿貝折光儀法測定可溶性固形物含量。透光率以蒸餾水作為對照,測定波長為625 nm[16]。色值以蒸餾水為對照測定420 nm波長處的吸光度[17]。

品質變化率的計算如公式(2)所示[18]:

(2)

式中:QR為品質變化率;A0為OTA脫除前葡萄汁的品質結果;A1為OTA脫除后葡萄汁的品質結果。

1.3.8 葡萄汁的香氣成分測定

移取8.00 mL葡萄汁于20.00 mL的頂空瓶中,加入2.56 g NaCl和內標物(20 μL 40 mg/L的2-辛醇)。葡萄汁在45 ℃下水浴平衡15 min,然后再用固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)頭萃取40 min,采用氣相色譜-質譜儀測定香氣成分[19]。采用峰面積歸一化法計算葡萄汁中不同種類香氣成分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 分散劑對nano-MgO荷正電無機陶瓷膜制備的影響

納米材料表面的覆蓋度直接受到涂膜液制備的影響,為了增加無機陶瓷膜表面的覆蓋度,保證nano-MgO更好的修飾到陶瓷膜內部,可通過加入分散劑來提高涂膜液的穩定懸浮性和分散性[20]。圖2對比了加入分散劑PEG前后制備的荷正電無機陶瓷表面nano-MgO的形態。未加入PEG時無機陶瓷膜表面nano-MgO的覆蓋度低,無機陶瓷基膜大多裸露在外,易于涂膜液沉積的凹陷部位上納米材料的修飾密度高,而其他部位修飾度則大大減少。PEG的加入顯著提高了陶瓷膜表面納米材料的覆蓋度,可以明顯觀察到nano-MgO均勻分布在膜的表面與孔徑內。由于無機陶瓷膜的荷電性能與nano-MgO的修飾量呈正相關,因此膜表面nano-MgO的修飾度越高,膜的荷電性能越佳;此外,nano-MgO作為OTA的主要結合位點,其固載量越大,吸附OTA的效果越好。由此可見,PEG的使用可有效提高無機陶瓷膜的修飾度,有助于提升荷電膜對OTA的吸附性能。

A-不使用PEG;B-使用PEG圖2 PEG使用前后nano-MgO荷正電無機陶瓷膜的表面形態Fig.2 Surface morphology of nano-MgO positively charged inorganic ceramic membranes with or without PEG

2.2 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜的性能表征

nano-MgO在無機陶瓷膜表面的負載量及分布情況直接影響膜的性能,采用掃描電子顯微鏡觀察無機陶瓷膜修飾納米材料前后的表面形態(圖3),結果發現無機陶瓷膜的表面平滑且具有孔洞結構,表面與孔徑內觀察不到顆粒狀的納米nano-MgO附著物(圖3-A)。而nano-MgO荷電膜可以觀察到大量均勻分布的立方體顆粒(圖3-B),意味著nano-MgO荷電涂層修飾在了基膜表面和微孔上。由于nano-MgO具有納米結構使得膜的比表面積顯著增加,膜的吸附能力也因此大大提升。采用透射電子顯微鏡觀察表征nano-MgO的晶體形狀和大小(圖3-C),發現nano-MgO為大小較為均勻的立方體,平均粒徑約100 nm。nano-MgO無機陶瓷膜的荷電性能通過Zeta電位進行表征(圖4)。結果表明無機陶瓷基膜的Zeta電位值為負值,是電負性無機膜。而涂覆nano-MgO顆粒后,當pH<12.8時,荷電膜的Zeta電位均為正值,說

A-nano-MgO修飾前表面形態;B-nano-MgO修飾后表面形態; C-nano-MgO晶體形態圖3 nano-MgO修飾前后無機陶瓷膜的表面及晶體形態Fig.3 Surface morphology and crystal morphology of inorganic ceramic membranes before and after nano-MgO modification

明pH<12.8的范圍內nano-MgO表面具有正電荷結合位點,與溶液中的氫離子結合后帶有正電,改變了無機陶瓷基膜的電負性,可通過靜電作用吸附帶負電的物質。

圖4 nano-MgO修飾前后無機陶瓷膜的Zeta電位Fig.4 Zeta potential of inorganic ceramic membranes before and after nano-MgO modification

2.3 OTA脫除條件的篩選

流速會改變OTA分子與荷正電膜的相互作用時間,從而對膜表面的吸附量產生了影響。圖5-A為蠕動泵脫除OTA時不同流速對于吸附率影響。當OTA溶液流速為47～470 μL/min時,吸附率隨流速的增大而顯著降低。流速為47 μL/min和141 μL/min時,OTA吸附率分別達到80%與79%,均能達到良好的脫除效果。但是,流速為47 μL/min時所需的脫除時間(12 h)為141 μL/min(3.5 h)的3.4倍。基于實驗結果,選擇蠕動泵141 μL/min為最佳流速進行試驗。

pH不僅直接決定了OTA在溶液中的存在狀態,而且影響了nano-MgO無機陶瓷膜表面的荷正電能力。針對不同pH條件的OTA溶液進行脫除試驗,結果如圖5-B所示。當溶液pH值由2增加至5時,吸附率隨pH的增加而增大;pH值為5和9時,吸附率分別為75.4%和76.5%,沒有顯著性差異;之后吸附率顯著增加至84.3%(pH=11)。雖然當pH=11時脫除效果最佳,但考慮到葡萄汁與葡萄酒多呈弱酸性,因此按照實際樣品需求,本實驗酸度條件選擇為pH=5。

涂膜液對膜內部的涂覆效果與無機陶瓷基膜的質量密切相關,且直接影響膜的荷電性能。采用相同直徑、不同質量的基膜制備nano-MgO荷正電無機陶瓷膜,并測試其吸附性能(圖5-C)。當基膜質量為0.5～2.0 g時,吸附率隨膜質量的增加而顯著增大。質量較大的基膜其表面積也較大,可以提供的nano-MgO修飾位點相應也較多,荷正電吸附位點的增加導致OTA的吸附率隨之增大。因此,制備荷電膜時確定無機陶瓷基膜的質量為2 g。

無論物理吸附還是化學吸附都會涉及吸熱與放熱過程,因此溫度是研究吸附效果必須考慮的影響因素之一。鑒于此,在25～45 ℃的溫度范圍內進行OTA的脫除,以此篩選最佳吸附溫度。如圖5-D所示,OTA的吸附率隨溫度的升高而降低,且溫度從35 ℃升高到45 ℃時,吸附率下降尤其顯著。說明nano-MgO

A-溶液流速;B-初始pH值;C-基膜質量;D-吸附溫度圖5 溶液流速、初始pH值、基膜質量和吸附溫度對OTA吸附率的影響Fig.5 Effects of flow rates, initial pH, dosage of nano-MgO positively charged inorganic ceramic membranes, and adsorption temperature on the adsorption rate of OTA注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

無機陶瓷膜對OTA的吸附適宜在低溫進行,OTA與荷電膜的相互作用符合放熱過程。由于高溫不利于OTA吸附,故后續實驗選擇在25 ℃,即室溫條件下進行。

2.4 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對葡萄汁中OTA的脫除

表1 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對葡萄汁中OTA的吸附Table 1 Adsorption of OTA in grape juice by nano-MgO positively charged inorganic ceramic membranes

2.5 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對葡萄汁品質的影響

通過物理截留來消除真菌毒素往往伴隨著食品的營養品質的損失。為了評價nano-MgO荷正電無機陶瓷吸附OTA前后葡萄汁品質的變化,系統測定了樣品中還原糖、總酚、可溶性固形物和色值等品質指標。OTA脫除前后葡萄汁品質見表2。紅葡萄汁中的還原糖在荷電膜處理后略有降低,而紫葡萄汁還原糖含量幾乎未受影響。2種葡萄汁中總酚含量處理后均有一定程度的增加,這或許與膜處理時水分的損失有關。雖然紅葡萄果汁中的可溶性固形物的含量處理前后無顯著性變化,但是紫葡萄果汁降低了14.6%。可溶性固形物與黏度的變化趨勢一致,如可溶性固形物含量降低,黏度值同樣降低。另一方面,黏度多與糖類物質的含量相關,糖的增多不利于保持果膠分子間結構,果汁黏度也會隨之增加[23]。因此,隨著可溶性固形物與還原糖變化,葡萄汁的黏度也隨之改變。處理后紫葡萄汁的透光率增加了35.18%,而紅葡萄汁的變化小于紫葡萄汁。紫葡萄汁顏色較深,處理前后色值雖然無顯著性差異,但其數值增加了16.24%,變化相對紅葡萄汁(4.84%)也較大,變的更加澄清,這可能與膜本身對大分子化合物(如多糖等)的物理截留有關。

2.6 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對葡萄汁香氣的影響

葡萄汁具有不同于其他果汁的特殊的香氣,對nano-MgO荷正電無機陶瓷膜處理前后葡萄汁的香氣變化進行評價,可以進一步評價荷電膜的實用性。如表3所示,nano-MgO荷正電無機陶瓷膜處理對紅葡萄汁和紫葡萄汁中香氣化合物的種類沒有產生影響,香氣物質種類分別為36和39種,其中醇類、醛類和酯類化合物所占比例比較高。雖然處理前后香氣物質的種類數量沒有發生變化,然而香氣物質的相對含量發生了變化(圖6)。紫葡萄汁中除酸類外其他化合物相對含量均發生了降低,酯類與醇類分別降低了2.2%與1.3%,其他化合物相對含量的變化更小。紫葡萄汁風味化合物的整體水平僅有小幅降低,整體風味得以保持,說明荷電膜對紫葡萄汁香氣成分的影響較小。而紅葡萄汁中酯類相對含量明顯下降(58.6%),醇類則增加了近一倍,其他化合物相對含量的改變相比酯類與醇類較小。葡萄汁的果香味主要來源之一為酯類物質,但是酯類化合物長時間接觸氧氣會加速其水解,使得酯類物質含量降低[24]。雖然酯類香氣成分有一定的損失,但是其他成分相對含量的增加有助于彌補整體風味。

表2 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜吸附處理前后葡萄汁的品質變化Table 2 Nutrient changes of grape juice before and after adsorption treatment with nano-MgO positively charged inorganic ceramic membranes

表3 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜吸附處理前后 葡萄汁的香氣物質數量的變化 單位:種

A-紅葡萄汁;B-紫葡萄汁圖6 nano-MgO荷正電無機陶瓷膜對紅葡萄汁和紫葡萄汁 香氣成分相對含量的影響Fig.6 Effect of nano-MgO positively charged inorganic diatomite ceramic membranes on relative contents of aroma substances of red grape juice and purple grape juice

3 結論

本文采用浸漬-熱分解法制備了nano-MgO荷正電無機陶瓷膜,并對材料的表面荷電與晶體形態等進行表征,考察了該材料對葡萄汁中OTA的吸附能力及對其品質的影響。結果表明nano-MgO呈立方體結構并較好的附著在陶瓷膜的表面與孔徑內,分散劑的使用可有效提高荷正電膜表面納米材料的修飾密度與比表面積。當蠕動泵流速為141 μL/min,無機陶瓷基膜質量為2.0 g,溶液溫度為25 ℃,溶液pH=5時OTA的脫除效果最佳。該材料對葡萄汁中OTA的脫除率高于91.57%,且葡萄汁中總酚、還原糖、色值和風味物質等整體品質得以保留。nano-MgO荷正電無機陶瓷膜提供了一種可以靜電吸附葡萄汁中OTA的新方法,通過改變荷電納米材料的種類與性質,該材料可推廣至其他真菌毒素與農殘的去除。