多肽His-Trp-His(HWH)修飾電極檢測Cd2+研究

耿成鋼,陳文濤,高蕙文,鄒平*

1(常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江蘇 常州,213022) 2(常州大學(xué) 藥學(xué)院,生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常州,213164)

對人體而言,有些重金屬元素,如錳、銅、鋅等微量元素對生命活動是至關(guān)重要的,但絕大部分的重金屬都不是人體生命活動所必需[1]。不同于有機(jī)污染物,重金屬不能被生物而降解[2],而且會在食物鏈的生物放大作用下[3],成幾百倍地累積下來,最終通過食物鏈而進(jìn)入人體。重金屬在人體內(nèi)會與蛋白質(zhì)、酶等發(fā)生作用,使它們的活性喪失。也可能逐漸累聚在人體的某些器官中,引起人體慢性中毒。重金屬離子的檢測方法可分為三大類[4-5]:光譜檢測技術(shù)、色譜檢測技術(shù)和電化學(xué)檢測技術(shù)。光譜方法包括原子吸收光譜法、原子熒光光譜法等,這些方法非常靈敏,但價(jià)格昂貴且需要費(fèi)力的預(yù)處理過程因此無法得到普及。原子吸收光譜法[6-7]是一種能夠通過測定氣化的基態(tài)原子的外層電子對紫外光及可見光的吸收強(qiáng)度,來定量被測元素含量的分析方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是具有較低的檢測限,較高的準(zhǔn)確度(火焰法相對誤差小于1%),其不足之處在于不能多種元素同時(shí)檢測[8]。原子熒光光譜法[9-10]通過測定被測元素的原子蒸汽在輻射能激發(fā)下所產(chǎn)生熒光的發(fā)射強(qiáng)度來對待測元素進(jìn)行分析。其檢出限低于原子吸收光譜法,具有較高的靈敏度、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍大、能夠多種元素同時(shí)測定等優(yōu)點(diǎn)。但是通過原子熒光光譜法能測定的金屬元素種類有限。色譜檢測技術(shù)[11]利用某一特定的色譜系統(tǒng)(薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統(tǒng))進(jìn)行混合物中各組分的分離分析,主要用于分析多組分樣品。高效液相色譜法[12]以液體作為流動相,通過高壓輸液系統(tǒng)使流動相進(jìn)入裝有固定相的色譜柱中,在色譜柱內(nèi)流動相中的各成分分離之后進(jìn)入檢測器內(nèi)進(jìn)行檢測,從而對試樣進(jìn)行分析。該法是應(yīng)用最為廣泛的重金屬離子檢測方法,具有“四高一廣”的特點(diǎn),即:高壓、高速、高效、高靈敏度及應(yīng)用范圍廣,此外,在該方法中色譜柱可以反復(fù)使用、樣品也不會被破壞,易于回收。但是該方法的操作較為繁瑣,得不到廣泛應(yīng)用。與光譜檢測技術(shù)、色譜檢測技術(shù)相比,電化學(xué)檢測技術(shù)因其具有良好的選擇性、便攜性、低成本、分析速度快和出色的靈敏度而被廣泛用于痕量重金屬離子的分析。PARNSUBSAKUL等[13]利用多肽EKEKEKPPPPC制備傳感器檢測Ni2+,15 min內(nèi)檢測到低至34 nmol/L的Ni2+,線性范圍為60～160 nmol/L,并且在土壤、尿液和水樣中穩(wěn)定。NISAR 等[14]通過制備電極實(shí)現(xiàn)對Zn2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+的電化學(xué)檢測,其檢測限均低于世界衛(wèi)生組織建議的閾值。LI等[15]借助多肽制備了一種選擇性檢測Pb2+的電化學(xué)傳感器。多肽的合成方法比較成熟,可通過固相多肽合成法來合成不同序列的多肽;多肽可與金屬離子快速鍵合從而形成非常穩(wěn)定的螯合物,以保證對金屬離子檢測的高靈敏性;其次不同序列的多肽與不同金屬離子的結(jié)合能力不同,這決定了多肽對金屬離子檢測的高選擇性[15];多肽的氨基酸序列可進(jìn)行優(yōu)化以提高其選擇性和靈敏度;多肽具有良好的生物相容性和細(xì)胞穿透能力。因此,基于多肽的化學(xué)傳感器成為當(dāng)今檢測環(huán)境重金屬離子的有效方法之一。

多肽作為生物體內(nèi)的活性物質(zhì)[16],對其進(jìn)行研究既有重要的理論意義,又有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于多肽對重金屬離子具有親和力[17]以及多肽本身對人體具有諸多好處,故而選擇以多肽作為電極修飾材料來制備多肽修飾電極,以已有的對重金屬離子的檢測方法以及對多肽的研究為基礎(chǔ),對利用多肽修飾電極檢測重金屬離子這一方法進(jìn)行探索和研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰醋酸、醋酸鈉、氯化鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、鹽酸、硫酸鎘,均為分析純,國學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;食品級殼聚糖,南通興成生物制品廠;多肽His-Trp-His (HWH)[≥95%(HPLC)],杭州中肽生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站,北京華科普天科技有限公司;232型甘汞電極,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;10 mm鉑片電極、3 mm玻碳電極,鹽城驕遠(yuǎn)分析儀器有限公司;FA2004電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 計(jì)算多肽與金屬Cd2+的相互作用

在本研究中采用分子對接構(gòu)建各金屬離子(Cd2+、Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+)與短肽HWH的結(jié)合模式。Schr?dinger2021-3軟件包中的Maestro軟件用于該分子對接工作。金屬離子以及HWH皆通過Maestro構(gòu)建。

在對接之前,通過LigPrep模塊計(jì)算短肽HWH在生理環(huán)境下的電荷狀態(tài)以及能量最低構(gòu)象。金屬離子與短肽HWH分子準(zhǔn)備好后,進(jìn)一步地,定義對接口袋的格點(diǎn)文件通過Maestro中受體格點(diǎn)準(zhǔn)備模塊(Receptor Grid Generation)生成,金屬離子的質(zhì)心被選作為活性口袋的中心,計(jì)算生成體積為30×30×30 ?3的格點(diǎn)文件。最后,準(zhǔn)備好的文件通過Glide對接模塊的SP精度的算法進(jìn)行分子對接。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 鐵氰化鉀溶液的配制

用精密天平分別稱取鐵氰化鉀0.823 2 g,亞鐵氰化鉀1.056 0 g,氯化鉀3.727 6 g,加入500 mL的蒸餾水,搖勻,裝入試劑瓶存于-4 ℃冰箱中待用。

1.3.2.2 緩沖溶液的配制

配制pH 5.0緩沖液,稱取8.20 g醋酸鈉與 5.72 mL醋酸,加入1 000 mL蒸餾水,搖勻。

1.3.2.3 Cd2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

所需的Cd2+離子溶液的質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/L,按硫酸鎘與緩沖液的比例分別進(jìn)行配制,待檢測。

以質(zhì)量濃度為0.25 mg/L,pH=5的Cd2+離子溶液的配制為例,用精密天平稱取0.05 g的硫酸鎘于100 mL燒杯中,加入適量已經(jīng)配制好的pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液,不斷攪拌,直至硫酸鎘固體完全溶解,然后將該溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中,用pH為5的緩沖液對其進(jìn)行定容,定容完成即得到了pH為5,質(zhì)量濃度為500 mg/L的Cd2+離子溶液。其他濃度的不同pH的Cd2+離子溶液的配制方法與該法相同。

1.3.3 電極的處理與表征

電極的表征采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中掃描的方法。設(shè)置實(shí)驗(yàn)技術(shù)為循環(huán)伏安法,起始電位和轉(zhuǎn)向電位分別為-0.2 V和0.6 V,掃描速率為0.1 V/s,記錄在-0.2～0.6 V掃描的循環(huán)伏安圖。

1.3.4 多肽電極的制備

在電極打磨干凈的條件下,進(jìn)行多肽修飾電極的制備,多肽電極的制備可采用兩種方法。

方法一:電化學(xué)沉積法[18]。先配制5.0 mg/mL的多肽-水溶液,將三電極體系放入裝有該溶液的燒杯中,并注意使3個(gè)電極的導(dǎo)電端處于溶液中同一高度,打開電化學(xué)工作站,設(shè)置實(shí)驗(yàn)技術(shù)為“時(shí)間-電流曲線”,富集電位設(shè)置為1.0 V,富集時(shí)間設(shè)為150 s,運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

方法二:滴涂法[19]。準(zhǔn)確稱取0.10 g多肽溶于5.0 mL蒸餾水,配制20 mg/mL多肽-水溶液,用移液槍移取50 μL該多肽溶液,將其滴到玻碳電極導(dǎo)電端表面,然后使其自然晾干;為使多肽盡可能多地存在于電極表面,可在電極表面先富集一層殼聚糖,由于殼聚糖具有很好的生物相容性,其分子中存在的氨基易與多肽結(jié)合并使多肽不受金屬離子的抑制,故可利用殼聚糖與多肽分子之間存在的氫鍵作用力,使得更多的多肽富集于電極表面。

分別使用上述2種方法來制備多肽電極,根據(jù)最終的表征結(jié)果,確定最利于實(shí)驗(yàn)的制備方法。

1.3.5 最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

影響檢測的因素可能有:溶液的pH、Cd2+離子在電極上的富集電位、富集時(shí)間。對這些因素逐個(gè)進(jìn)行考察,能夠得出以上因素對實(shí)驗(yàn)的影響情況,與此同時(shí)也能確定出實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

1.3.5.1 溶液最佳pH[20]的確定

分別配制pH為3、4、5、6、7、8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液,并分別用這些pH的緩沖液配制質(zhì)量濃度為0.25 mg/L的Cd2+離子溶液。富集電位設(shè)置為-1.0 V,采樣間隔0.1 s,富集時(shí)間150 s。

1.3.5.2 最佳富集時(shí)間[21]的確定

根據(jù)上一步的實(shí)驗(yàn)可得到最佳pH為6。以質(zhì)量濃度為0.25 mg/L,pH為6的Cd2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶液作為檢測對象。設(shè)置實(shí)驗(yàn)技術(shù)為“電流-時(shí)間曲線”,富集電位為-1.0 V,采樣間隔為0.1 s,富集時(shí)間依次設(shè)置為25、50、75、100、125、150、175 s。

1.3.5.3 最佳富集電位[22]的確定

選與上一步實(shí)驗(yàn)中相同濃度、相同pH的Cd2+離子溶液作為實(shí)驗(yàn)對象。先設(shè)置實(shí)驗(yàn)技術(shù)為“電流-時(shí)間曲線”,設(shè)置富集時(shí)間為表2中所得到的最佳富集時(shí)間(150 s),富集電位設(shè)置為-0.9、-1.0、-1.1、-1.2、-1.3 V,設(shè)置好參數(shù)后打開攪拌,并運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

以上實(shí)驗(yàn)考察了pH、富集電位、富集時(shí)間對于多肽電極檢測重金屬Cd2+離子的影響,由這一系列的考察也可以最終得出用多肽電極檢測重金屬離子的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

上述實(shí)驗(yàn)確定出了檢測的最佳條件。根據(jù)對pH考察實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,配制出pH為6的緩沖液,并用該緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/L的Cd2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。按濃度由小到大的順序,在最佳條件下逐一對這些濃度的Cd2+離子溶液進(jìn)行檢測。

設(shè)置實(shí)驗(yàn)技術(shù)為“方波伏安法”,設(shè)置初始電位為-1.0 V,終止電位為-0.2 V,運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。依次檢測各個(gè)濃度的Cd2+離子溶液,以Cd2+離子濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的溶出峰電流值為縱坐標(biāo),繪制出Cd2+離子濃度與電流峰值的關(guān)系曲線,對曲線進(jìn)行擬合,可得到Cd2+離子溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 電極的重復(fù)性檢測

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,對同一濃度、同pH的Cd2+離子溶液重復(fù)檢測9～10次,比較幾次重復(fù)檢測所得的方波伏安曲線中的溶出峰電流值,計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值的大小可以判斷在該實(shí)驗(yàn)條件下多肽電極的穩(wěn)定性。先按照公式(1)可計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差值,通過公式(2)可計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值:

(1)

式中:S為標(biāo)準(zhǔn)偏差;Xi分別為各次檢測所得方波伏安曲線中的峰電流值;X為i次檢測得到的溶出峰電流的平均值;i為檢測次數(shù)。

RSD=S/X

(2)

式中:RSD,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.8 檢測限的計(jì)算

根據(jù)所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)合3倍信噪比公式(3)可計(jì)算出檢測限:

D=3S/k

(3)

式中:D為檢測限;S為n次檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差;k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.9 回收率實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證多肽電極檢測Cd2+離子這一方法的實(shí)用性,使用該電極對飲用水、大學(xué)城內(nèi)采集到的湖水以及某飲料(無明顯顏色)分別進(jìn)行檢測。首先,檢驗(yàn)水樣中是否含有Cd2+離子:分別量取3種水樣1 mL,并分別加入9 mL確定為最佳pH的緩沖溶液,先對這2種體系的溶液在最佳條件下進(jìn)行檢測,若檢測發(fā)現(xiàn)水樣含Cd2+離子,則需結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算出其中Cd2+離子的濃度值;若未檢出Cd2+離子,則標(biāo)注為未檢出。再分別量取1 mL 3種水樣兩份,每種水樣里分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL最佳pH、質(zhì)量濃度為0.30 mg/L的Cd2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,之后加入8.5、8.0、7.5、7.0 mL最佳pH的緩沖液,使體系總體積為10 mL,在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)行檢測,每組平行檢測6次。根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行回收率的計(jì)算,回收率越接近100%,分析方法和過程的準(zhǔn)確度就越高,根據(jù)計(jì)算結(jié)果可判斷出該方法的實(shí)用性以及準(zhǔn)確度。同時(shí)與原子光譜法[9]以及電感藕合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass, ICP-MS)對照,電感耦合等離子體質(zhì)譜法參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》。

回收率的計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:P代表回收率;C1代表加樣后測定得到的總濃度;C2代表未加標(biāo)使得測定值;C標(biāo)表示加表濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 9.0處理及結(jié)果分析,靜電勢計(jì)算使用Discovery Studio。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽與金屬Cd2+的相互作用

為研究不同金屬離子(Cd2+、Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+)與HWH的相互作用,采用量子化學(xué)的方法,將HWH與不同金屬離子(Cd2+、Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+)進(jìn)行結(jié)合。結(jié)果如圖1所示,黃色虛線表示螯合作用,數(shù)字表示作用距離,通常距離越短表示螯合作用越強(qiáng)。結(jié)果顯示,金屬離子Cd2+結(jié)合在HWH之間,和2個(gè)酰胺鍵上的碳基發(fā)生螯合作用,此外還和C-terminal His上的羧基發(fā)生螯合作用。螯合作用的距離分別為2.0、2.1、2.4 ?,相較于Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+結(jié)合距離較近,意味著Cd2+結(jié)合在HWH上的螯合作用比較強(qiáng)。對接過程中還獲取了金屬離子和HWH短肽的結(jié)合能打分。軟件顯示Cd2+、Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+與HWH的結(jié)合能分別為-6.4、-4.4、-5.0、-4.2、-3.4、-4.2 kcal/mol。從結(jié)合能上看,Cd2+與HWH的結(jié)合能略強(qiáng)于其余的金屬離子。

2.2 電極的處理與表征

在使用所有的固體電極之前都必須要對其表面進(jìn)行清潔,以除去電極表面因?yàn)殓栉刍蛭诫s質(zhì)而造成的污染。大部分金屬電極的表面都很容易生成氧化層。玻碳電極的表面發(fā)生氧化后,就會產(chǎn)生各種含氧基團(tuán)(如酚類、醇類、羧基、酮醌及酸酐等)。這些物質(zhì)的存在會使電極的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性變差,靈敏度下降,使電極失去原有的選擇性。

對于玻碳電極而言,如果選擇以電極在鐵氰化鉀溶液中掃描得到的循環(huán)伏安曲線來測試其性能的話,就要求所得到的循環(huán)伏安曲線中2個(gè)峰的峰電位之差要小于100 mV,滿足此要求的電極方可使用,否則就需要對其重新進(jìn)行處理,直到符合要求為止。

該循環(huán)伏安曲線是在電極上施加-0.2～0.6 V的線性電壓,在鐵氰化鉀溶液中掃描得到的。從-0.2 V開始掃描,達(dá)到終止電位0.6 V后,再負(fù)向掃描回-0.2 V。正向掃描的過程中,電極上發(fā)生還原反應(yīng),負(fù)向掃描的過程中,電極上存在的被還原的物質(zhì)又會被氧化,如此循環(huán)。由圖2可獲得氧化峰電流與還原峰電流以及氧化峰電位與還原峰電位。根據(jù)循環(huán)伏安曲線中的信息可以判斷電極是否可逆。該循環(huán)伏安曲線中的電位峰值之間的差值大小滿足實(shí)驗(yàn)電位差的條件,故可說明電極已被打磨干凈,可以使用該電極來進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.3 多肽電極的制備

分別嘗試了采用電化學(xué)沉積法和滴涂法來制備多肽電極。并分別對2種方法制備出來的復(fù)合電極通過循環(huán)伏安曲線來進(jìn)行表征,掃描速率設(shè)置為0.1 V/s,記錄-0.2～-0.6 V的掃描曲線并將得到的曲線與裸電極在鐵氰化鉀溶液中表征所得的循環(huán)伏安曲線進(jìn)行對比(圖3)。

由圖3看出,采用不同的方法富集多肽之后,電極在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行掃描所得到的循環(huán)伏安曲線的電流峰值都有所增加,這就說明用2種方法都可以成功地制備出多肽電極。比較2張圖中的曲線,對應(yīng)各個(gè)曲線的標(biāo)簽,可以看出電化學(xué)沉積法制備的多肽電極以及用滴涂法直接滴加多肽所得到的復(fù)合電極的循環(huán)伏安曲線與裸玻碳電極的循環(huán)伏安曲線之間的差異并不明顯。滴涂法直接滴加多肽和電化學(xué)沉積法2種方法制備出的多肽電極效果差異并不是很大。與此同時(shí),能夠明顯地看出圖3-b中富集了殼聚糖之后又滴加多肽的電極的循環(huán)伏安曲線相較于其他復(fù)合電極的循環(huán)伏安曲線的變化更為明顯,其電流峰值的增大更為顯著。這也就說明,殼聚糖與多肽分子之間的氫鍵作用力能夠使多肽分子更好地富集在電極表面,這對于多肽修飾電極的制備起到了很好的輔助作用。綜上所述,在接下來的研究中實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用滴涂法,先富集殼聚糖,再滴涂多肽的方法制備多肽電極。

a-電化學(xué)沉積法制備出來的多肽電極的循環(huán)伏安曲線與裸電極 循環(huán)伏安曲線的對比圖;b-采用滴涂法分別直接滴加多肽以及 先富集殼聚糖再滴加多肽后制備出的多肽電極的循環(huán)伏安 曲線與裸電極循環(huán)伏安曲線的對比圖圖3 不同方法制備的多肽電極與裸玻碳電極循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry of polypeptide electrode and bare glass carbon electrode prepared by different methods

2.4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由圖4-a可以很直觀地看出Cd2+離子溶液的pH值對檢測的影響情況。pH<6時(shí),隨著電解質(zhì)pH的增長,Cd2+離子的氧化峰電流值也不斷增長。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是,在pH較低的情況下,多肽結(jié)構(gòu)中的氮元素與氫離子之間通過氫鍵作用力結(jié)合,這就導(dǎo)致了多肽中氮的活性位點(diǎn)數(shù)目減少,從而減弱了對Cd2+離子的吸附絡(luò)合作用,也可能是因?yàn)榕c氮元素氫鍵結(jié)合的氫離子對Cd2+離子產(chǎn)生了排斥力,從而使得Cd2+離子溶出峰電流值降低。所以,如圖4-a所示,pH較小時(shí),Cd2+離子溶出峰電流值也比較小。當(dāng)pH一直上升到6以后,溶出峰電流值呈現(xiàn)減弱的趨勢,這可能是因?yàn)镃d2+離子出現(xiàn)了水解的緣故。所以該部分實(shí)驗(yàn)可證明在該方法中最佳的pH為6,對于實(shí)驗(yàn)最佳條件的進(jìn)一步探索應(yīng)該以pH為6、質(zhì)量濃度為0.25 mg/L的Cd2+離子溶液作為對象繼續(xù)進(jìn)行。

在確定實(shí)驗(yàn)最佳pH為6的情況下,在檢測過程中分別設(shè)置金屬離子的富集時(shí)間為25、50、75、100、125、150、175、200 s,對質(zhì)量濃度為0.250 mg/L、pH為6的Cd2+離子溶液進(jìn)行檢測,以檢測過程中所設(shè)置的富集時(shí)間值為橫坐標(biāo),各個(gè)時(shí)間對應(yīng)的方波伏安曲線中的溶出峰電流值為縱坐標(biāo),繪制出富集時(shí)間與峰電流值的關(guān)系曲線,如圖4-b所示,該關(guān)系曲線表明了Cd2+離子富集時(shí)間對檢測結(jié)果的影響情況,由圖4-b可以看出,在富集時(shí)間≤150 s時(shí),隨著富集時(shí)間的延長,沉積到修飾電極表面的重金屬Cd2+也逐漸增多,溶出峰電流值也隨之逐步增大;但繼續(xù)延長Cd2+離子的富集時(shí)間,直至大于150 s之后,Cd2+離子溶出峰電流值呈緩慢下降趨勢。這就說明,電流溶出峰的值并不會隨著富集時(shí)間的延長而無限制地增大,可能還與被測溶液中Cd2+離子的濃度、電極材料以及電極面積的大小等因素相關(guān)。因此,該部分實(shí)驗(yàn)可以確定,在用多肽電極檢測Cd2+的方法中,Cd2+離子的最佳富集時(shí)間為150 s,接下來的實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)以pH為6、質(zhì)量濃度為0.25 mg/L的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液作為實(shí)驗(yàn)對象,在Cd2+離子富集過程中應(yīng)設(shè)置富集時(shí)間為150 s,以此來考察其他因素對實(shí)驗(yàn)的影響情況。

a-pH值;b-富集時(shí)間;c-富集電位圖4 不同因素對溶出峰電流值的影響Fig.4 Influence of different factors on stripping peak current value

富集電位是在離子富集過程中所施加的電壓,該電壓值的大小與溶液中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)以及體系的內(nèi)環(huán)境密切相關(guān)。在伏安分析法中,富集電位對方法靈敏度的影響很大,在此過程中仍然以pH為6、質(zhì)量濃度為0.250 mg/L的Cd2+離子溶液作為實(shí)驗(yàn)對象,檢測過程中設(shè)置Cd2+的富集時(shí)間為150 s,分別設(shè)置富集電位為-0.9、-1.0、-1.1、-1.2、-1.3 V,記錄在各個(gè)富集電位下進(jìn)行檢測所得的方波伏安曲線,并以實(shí)驗(yàn)過程中所設(shè)置的電位值為橫坐標(biāo),對應(yīng)的溶出峰電流值為縱坐標(biāo),繪制出相應(yīng)的關(guān)系曲線,如圖4-c即為富集電位與溶出峰電流值的關(guān)系曲線,由圖中關(guān)系曲線可以看出,隨著實(shí)驗(yàn)設(shè)置的富集電位值逐漸小于Cd2+的溶出電位(-0.8 V),Cd2+溶出峰電流值也就越大,Cd2+的響應(yīng)電流逐漸增高。造成該現(xiàn)象的原因可能是,隨著富集電位的減小,Cd2+離子還原成鎘單質(zhì)的驅(qū)動力在不斷地增大,工作電極表面產(chǎn)生的還原金屬就會越來越多,直到富集電位減小至-1.1 V 時(shí),溶出峰電流值達(dá)到最大。繼續(xù)減小富集電位,溶出峰電流值便會開始下降,出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是,富集電位值的負(fù)向增大會使得溶液中的其他物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)而析出。例如,氫氣的產(chǎn)生。這就會對檢測產(chǎn)生很大的干擾,從而會使溶出峰電流值開始下降,故而Cd2+的響應(yīng)電流也會下降,所以根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定實(shí)驗(yàn)最佳的富集電位值為-1.1 V。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測與繪制

設(shè)置各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)部分所得到的最佳條件,分別對質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 L、0.50 mg/L的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH=6)進(jìn)行檢測。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線可看出在0.001～0.30 mg/L的濃度內(nèi),Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與溶出峰電流值的線性方程為I(μA)=86.78×C(mg/L)+0.171 0,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測與繪制Fig.5 Standard curve detection and drawing

多肽HWH制備電極檢測不同重金屬離子(Cd2+、Cr2+、Cu2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+),發(fā)現(xiàn)其對于Cd2+的檢測能力較為顯著,這可能是量子化學(xué)篩選出了金屬結(jié)合肽HWH與Cd2+的最佳結(jié)合力場,同時(shí)由于金屬結(jié)合肽的高選擇性[15],導(dǎo)致其對不同金屬離子的檢測能力有所差異。

2.6 電極的重復(fù)性檢測

在已知的最佳條件下對質(zhì)量濃度為0.25 mg/L、pH=6的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測,重復(fù)檢測9次,9次檢測所得到的方波伏安曲線圖中溶出峰電流值如表1所示,根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)就可以計(jì)算出該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值。由相對偏差值得大小即可以判斷在當(dāng)前條件下該方法的準(zhǔn)確度及檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。

圖6 不同金屬離子的檢測Fig.6 Detection of different metal ions

表1 0.25 mg/L Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(n=9)Table 1 Detection of 0.25 mg/L cadmium ion standard solution (n=9)

將9次檢測實(shí)驗(yàn)所得到的溶出電流峰值計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.012 4,RSD=4.45%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程以及標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算結(jié)果,根據(jù)3倍信噪比的公式可計(jì)算出該方法的檢測限:計(jì)算可以得到D=4.301×10-4mg/L,即該方法的檢測限可以達(dá)到0.430 1 μg/L。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

為考察多肽電極檢測Cd2+這一方法的應(yīng)用性,應(yīng)用該修飾電極對飲用水、大學(xué)城湖水以及某飲料(無明顯顏色)進(jìn)行檢測,分別量取3種水樣1.0 mL,并加入9.0 mL緩沖溶液(pH=6),先對該體系在最佳條件下進(jìn)行檢測。接下來再分別量取1 mL 3種水樣,2種水樣中都分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL pH為6質(zhì)量濃度為0.30 mg/L的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液,再加入8.5、8.0、7.5、7.0 mL的pH為6的緩沖液,在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)行檢測。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法回收率的測定,每組平行檢測6次,測定結(jié)果如表2所示。

先對3種水樣品進(jìn)行檢測,檢測發(fā)現(xiàn),飲用水以及某飲料中未檢出Cd2+,湖水中Cd2+質(zhì)量濃度約為0.88 μg/L。在水樣中加入不同量的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測所得到的方波伏安曲線中的溶出峰電流值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程I(μA) = 86.78×C(mg/L)+0.171 0進(jìn)行計(jì)算,即可得到被檢樣品中Cd2+的濃度。根據(jù)回收率的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算,即可得到回收率。計(jì)算結(jié)果表明,3種加入了不同Cd2+的回收率均為97.4%～103.5%,原子光譜回收率為98.3%～100.1%,ICP-MS的回收率為97.9%～99.6%,變異系數(shù)均低于10%。這就說明使用多肽復(fù)合電極來檢測Cd2+這一方法的準(zhǔn)確度相對還是比較高的,這也就進(jìn)一步證明了該方法的可行性。

表2 不同水中Cd2+的檢測(n=6)Table 2 Detection of cadmium ions in tap water (n=6)

3 結(jié)論

本文研究了使用多肽修飾的玻碳電極,在醋酸-醋酸鈉的緩沖液中,通過方波伏安法來檢測重金屬Cd2+,實(shí)驗(yàn)逐一優(yōu)化了修飾電極的制備方法、緩沖液的pH、富集Cd2+的時(shí)間以及富集電位等影響檢測的因素,最終證明在緩沖溶液pH= 6,富集時(shí)間為150 s,富集電位為-1.1 V的實(shí)驗(yàn)條件下檢測達(dá)到最優(yōu)。實(shí)驗(yàn)證明,在最優(yōu)的檢測條件下,此多肽電極對于Cd2+有著很好的響應(yīng),當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度為0.001～0.30 mg/L時(shí),Cd2+溶液的濃度與Cd2+溶出峰電流值之間存在著良好的線性關(guān)系,經(jīng)擬合后得到其線性方程為I(μA)=86.78×C(mg/L)+0.171 0,R2為0.998 9,通過三倍信噪比公式進(jìn)行計(jì)算,得到該方法的檢出限D(zhuǎn)=4.301×10-4mg/L。在對其穩(wěn)定性考察的過程中,發(fā)現(xiàn)平行檢測實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=4.45%,相對于其他方法較高,這可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中未對被測體系的溫度進(jìn)行控制而導(dǎo)致的。此外,用該方法對飲用水、大學(xué)城湖水以及某飲料進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示其加標(biāo)回收率達(dá)到97.4%～103.5%。一系列的實(shí)驗(yàn)都能證明該方法能夠?qū)嶋H用于Cd2+的檢測,但是各方面的條件仍然有待于進(jìn)一步的優(yōu)化。例如,需要對制備多肽電極時(shí)富集的多肽的量以及實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的溫度進(jìn)行更加精確的考察,以使檢測效果達(dá)到最佳。