不同免疫增效劑對(duì)免疫豬瘟E2蛋白亞單位疫苗小鼠抗體的影響

摘要：為了研究不同免疫增效劑對(duì)免疫豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗小鼠產(chǎn)生特異性抗體與鼠IFN-γ水平的影響。本研究將昆明白小鼠隨機(jī)分為6組： CpG-A組、CpG-B組、復(fù)合增效劑組[單磷酰脂質(zhì) A（MPL）：胞壁酰二肽（MDP）：β-葡聚糖=1：1：1]、納米顆粒組、豬瘟E2疫苗組，非免疫對(duì)照組（Control組）。實(shí)驗(yàn)共使用6種免疫增效劑：CpG-A、CpG-B、單磷酰脂質(zhì) A（MPL）、胞壁酰二肽（MDP）、β-葡聚糖、納米顆粒與豬瘟E2 蛋白（40 μg/mL）混合制備疫苗，小鼠經(jīng)皮下注射疫苗定期眼眥采血，分別使用豬瘟E2抗體檢測(cè)試劑盒與鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒測(cè)定豬瘟病毒E2蛋白特異性抗體和鼠IFN-γ水平。免疫后小鼠檢測(cè)結(jié)果顯示，首免后 35天 CpG-B組、復(fù)合增效劑組小鼠血清樣品豬瘟E2抗體均高于豬瘟E2組，CpG-B組與豬瘟E2組比較抗體水平差異顯著（F=0.048，p＜0.05），復(fù)合增效劑組與豬瘟E2組比較抗體水平差異極顯著（F=0.008，p＜0.01）；CpG-A、納米顆粒組與豬瘟E2組比較，抗體水平差異不顯著（FCpG-A=0.56、F納米顆粒=0.35，p＜0.05），CpG-B組與復(fù)合增效劑組效果對(duì)于豬瘟E2疫苗特異性抗體促進(jìn)作用顯著。綜合以上研究結(jié)果首次表明，添加復(fù)合增效劑制成的疫苗進(jìn)行單次免疫后，均能有效提高免疫后小鼠的豬瘟E2蛋白特異性抗體的水平；CpG-B與復(fù)合增效劑均能有效提高小鼠血清中豬瘟病毒中和抗體的水平；CpG-B能促進(jìn)免疫后7～14 d小鼠IFN-γ的上調(diào)。本研究為昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白制備亞單位疫苗的免疫增效劑開發(fā)和研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：免疫增效劑；中和抗體；豬瘟E2蛋白；鼠IFN-γ

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，具有極高的致死率，給許多國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù) “中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告—第573號(hào)”內(nèi)容，豬瘟為二類動(dòng)物疫病，屬于WOAH必須上報(bào)的動(dòng)物疫病。疫苗免疫是我國(guó)預(yù)防豬瘟病毒的主要手段，我國(guó)普遍利用自行研制的豬瘟兔化弱毒疫苗（C株）進(jìn)行強(qiáng)制免疫來(lái)預(yù)防豬瘟病毒的流行。目前中國(guó)豬瘟仍然沒有被完全控制住，我國(guó)豬瘟的流行方式已經(jīng)從頻繁發(fā)生的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)樵S多地區(qū)周期性零星流行，多局限于“CSFV不穩(wěn)定地區(qū)”的散發(fā)性流行[1]。對(duì)病豬場(chǎng)及附近尚未發(fā)病的豬，立即進(jìn)行緊急接種豬瘟疫苗，病死豬的尸體應(yīng)進(jìn)行合理化的處理。這些都以期有效降低豬瘟的發(fā)生幾率，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益[2]。近年來(lái)研發(fā)出的豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗，免疫后具有特異性抗體水平高，免疫持續(xù)期長(zhǎng)，無(wú)副反應(yīng)，可鑒別診斷等特點(diǎn)，是一種新型豬瘟疫苗。該疫苗所選取的E2基因保留了信號(hào)肽序列，制苗使用在上清中正確表達(dá)的重組E2蛋白，表達(dá)量顯著提高，具有大規(guī)模推廣應(yīng)用的潛力[3]。為提高豬瘟E2蛋白亞單位疫苗誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，并減輕豬場(chǎng)對(duì)豬瘟疫苗的免疫壓力，本試驗(yàn)開展免疫增效劑的研究，以期為豬瘟E2蛋白亞單位疫苗研究提供依據(jù)。

免疫增效劑是指單獨(dú)使用或者與抗原聯(lián)用均能提高機(jī)體免疫力的藥物。近年來(lái)研究表明，多種免疫增效劑均能夠提高免疫功能，并協(xié)同增強(qiáng)機(jī)體的抗體水平。CpG ODN（cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide），未甲基化寡聚脫氧核苷酸，是指含有 CpG 基序的核苷酸序列。A型CpG ODN 能夠活化NK細(xì)胞，B型CpG ODN能刺激B細(xì)胞的增殖和活化，可上調(diào)表達(dá) MHC II 分子、B 細(xì)胞表面分子、六種主要免疫球蛋白等多種基因，并促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌[4]。β-葡聚糖是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一個(gè)溫和應(yīng)激原，其通過腸道中樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活來(lái)刺激免疫系統(tǒng)。β-葡聚糖是一種微生物衍生的直鏈或支鏈的3-1，3-葡萄糖多糖，可與C型凝集素dectin-1和補(bǔ)體受體3（CR3）結(jié)合，促進(jìn)分泌細(xì)胞因子和B細(xì)胞、T細(xì)胞的激活，增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng) [5]。單磷酰脂質(zhì)A是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）主要成分之一。單磷酰脂質(zhì) A（monophosphoryl lipid A，MPL）作為L(zhǎng)PS的重要組成部分在免疫信號(hào)傳導(dǎo)中參與了與這些生物大分子的結(jié)合和引發(fā)受體蛋白構(gòu)象的變化，進(jìn)一步將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[6]。單磷酸脂質(zhì) A 具有比傳統(tǒng)鋁鹽佐劑更強(qiáng)的免疫活性、有效性和安全性，其作為佐劑已在多個(gè)上市疫苗中的應(yīng)用[7]。胞壁酰二肽類免疫增效劑是指包括胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）在內(nèi)的一類具有免疫調(diào)節(jié)活性的 MDP 衍生物和類似物。MDP 是分枝桿菌細(xì)胞壁骨架中的主要免疫活性單元，可通過口服、皮下、靜脈等多種途徑進(jìn)入體內(nèi)，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，提高疫苗、菌苗、病毒亞單位及寄生蟲苗的保護(hù)力[8]。MDP在LPS誘導(dǎo)下可以顯著增加IL-1的產(chǎn)生，MDP對(duì)B淋巴細(xì)胞顯著增強(qiáng)的作用，MDP可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，優(yōu)先作用于B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生明顯的抗體介導(dǎo)免疫反應(yīng)[9]。納米佐劑是指一類特殊的免疫佐劑，其獨(dú)特性在于是由納米材料所構(gòu)成的。它不但能夠保護(hù)抗原免受降解，還可以作為抗原的靶向遞呈載體，同時(shí)其本身也具有刺激免疫的能力[10]。目前應(yīng)用廣泛的納米材料多為聚合物，進(jìn)入機(jī)體可以被生物降解為無(wú)毒性的小顆粒，安全性高，同時(shí)能夠激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答而不損害機(jī)體，生物相容性良好。

1 "材料與方法

1.1 "主要實(shí)驗(yàn)材料

MPL、MDP和 β-葡聚糖均購(gòu)自 Invivogen 公司；納米顆粒購(gòu)自默克公司；CpG-A，CpG-B購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)愛德士公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗豬 IgG-HRP購(gòu)自Sigma；豬瘟陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種保存保藏中心。昆明白小鼠購(gòu)自烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心。ISA 660VG 佐劑購(gòu)自法國(guó)賽彼科公司。

1.2 "疫苗制備

將經(jīng)鑒定后的豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒按 MOI=2 接種于High Five懸浮細(xì)胞，27 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng) 96 h 后收獲上清，經(jīng) 30 ku 超濾濃縮-鎳親和柱層析分離純化。純化后的豬瘟E2蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，同時(shí)采用灰度分析測(cè)定蛋白濃度。豬瘟陽(yáng)性血清（1：500）為一抗，兔抗豬 IgG-HRP（1：5000）為二抗，經(jīng) western blot 鑒定豬瘟病毒E2 蛋白的表達(dá)。豬瘟E2蛋白（終濃度 40 μg/mL）分別與 CpG-A（終濃度 20 μg/mL）、CpG-B（終濃度10 μg/mL）、復(fù)合增效劑組為MPL、MDP和 β-葡聚糖依照1：1：1比例混合制成（終濃度為20 μg/mL）、納米顆粒組（終濃度2 μg/mL）、混勻制備含不同免疫增效劑的豬瘟E2蛋白抗原混合液，按照 1：1（g/g）比例將 ISA 563VG 佐劑分別添加至上述豬瘟E2蛋白抗原混合液中，乳化制備4種疫苗，同時(shí)制備不含免疫調(diào)節(jié)劑的ISA 563VG 佐劑豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒疫苗。

1.3 "小鼠免疫及樣品采集檢測(cè)

將 18～22 g 昆明白小鼠48只隨機(jī)分為 6 組，每組 8只，第 1 組為CpG-A組，第 2 組為CpG-B組，第 3 組為復(fù)合增效劑組，第 4 組為納米顆粒免疫組，第 5 組為豬瘟E2組，第 6組為非免疫對(duì)照組（Control 組）。各組小鼠采用背部皮下免疫接種方式，免疫相應(yīng)疫苗 0.1 mL/只。

1.4 "小鼠安全性監(jiān)測(cè)

疫苗首免后連續(xù)觀察 7 d，記錄各組小鼠狀態(tài)。首免后0、7天，分別對(duì)各組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量，計(jì)算相對(duì)增重。

相對(duì)增重=（免疫后7日質(zhì)量lt;ggt;-免疫前質(zhì)量lt;ggt;）/（免疫前質(zhì)量lt;ggt;）

1.5 "小鼠血清中豬瘟E2抗體ELISA檢測(cè)

將 1.3 中采集的各組小鼠血清依照豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒說明書稀釋，對(duì)各組小鼠首免后第0、7、14、21、35天血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。

1.6 "小鼠血清中IFN- γ檢測(cè)

將 1.3 中采集的各組小鼠血清依照鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒說明書稀釋，對(duì)各組小鼠首免后第7、14、21、35天血清進(jìn)行鼠IFN-測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 豬瘟E2蛋白制備結(jié)果

豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒接種 High Five細(xì)胞后收集培養(yǎng)液經(jīng)濃縮純化后，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)及灰度分析測(cè)定結(jié)果顯示，檢測(cè)到與預(yù)期一致的 50 ku 目的條帶，蛋白濃度為 56μg/mL（圖 1.A）。western blot 特異性鑒定結(jié)果顯示該蛋白為豬瘟E2 特異性蛋白（圖 1.B）可用于疫苗制備。

2.2 免疫小鼠安全性觀察結(jié)果

免疫小鼠后 7 d內(nèi)連續(xù)觀察并記錄小鼠狀態(tài)，結(jié)果顯示，除 Control 組小鼠外，其他各組小鼠在疫苗接種部位均出現(xiàn)被毛雜亂、突起潤(rùn)濕現(xiàn)象，并在免疫后3 d內(nèi)體表特稱全部恢復(fù)正常；觀察期內(nèi)各組小鼠采食及活動(dòng)正常；小鼠注射局部未觀察到潰爛、脫毛等不良癥狀。免疫0、7 d對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示 CpG-A 組、豬瘟E2組、納米顆粒組的小鼠體重相對(duì)增重值大于 Control 組，CpG-B組、復(fù)合增效劑組體質(zhì)量相對(duì)增重值小鼠體重相對(duì)增重值小于 Control 組，但以上差異均不顯著（p＞0.05）（圖 2）。上述結(jié)果表明，各免疫增效劑對(duì)小鼠安全性良好。

2.3 免疫后小鼠血清豬瘟E2抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠分別于首免后第0、7、14、21、35天采集血清，經(jīng) ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬瘟E2蛋白特異性抗體。結(jié)果顯示， Control 組小鼠各時(shí)期血清樣品的豬瘟E2特異性抗體均為陰性；其他各組35 d全部為陽(yáng)性；首免后第7、14、21天，各實(shí)驗(yàn)組之間小鼠血清樣品豬瘟E2抗體水平差異不顯著（p＞0.05），首免后第35天其中CpG-B組、復(fù)合增效劑組小鼠血清樣品豬瘟E2抗體豬瘟E2組，CpG-B組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異顯著（F=0.048，p＜0.05），復(fù)合增效劑組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異極顯著（F=0.008，p＜0.01）；CpG-A、納米顆粒組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異不顯著（FCpG-A=0.56、F納米顆粒=0.35，p＞0.05）（圖 3）。上述結(jié)果表明，免疫增效劑 CpG-B能夠顯著提高豬瘟E2亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平，復(fù)合增效劑能夠極顯著提高豬瘟E2亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平。

2.4 試驗(yàn)小鼠中和抗體測(cè)定結(jié)果

各組首免后第14、21、35天血清進(jìn)行中和抗體測(cè)定。結(jié)果顯示，復(fù)合增效劑組第35 天中和抗體效價(jià)最高；首免后第35天 CpG-B組中和抗體效價(jià)顯著高于豬瘟E2組（F=0.022，p＜0.05）；復(fù)合增效劑組中和抗體效價(jià)極顯著高于豬瘟E2組（F=0.0026，p＜0.01），Control 組豬只各時(shí)期血清樣品的中和抗體效價(jià)不高于1：4。結(jié)果表明，在首免后第35天，CpG-B組可顯著提高中和抗體水平，復(fù)合增效劑組能夠極顯著維持高水平中和抗體水平。

2.5 各組實(shí)驗(yàn)鼠IFN-γ檢測(cè)結(jié)果

對(duì)首免后第7、14、21、35天血清中鼠IFN-γ進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，首免后第7天 CpG-B組鼠IFN-γ顯著高于豬瘟E2組（F=0.043，p＜0.05）；首免后第14天 CpG-B組鼠IFN-γ顯著高于豬瘟E2組（F=0.042，p＜0.05）；首免后第21、35天 復(fù)合增效劑組、CpG-B組間對(duì)比豬瘟E2組IFN-γ水平無(wú)差異顯著性。結(jié)果表明，CpG-B組在首免后0～14 d期間可提高鼠IFN-γ水平（5.77～52.09 pg/mL），其他增效劑組未能顯著維持高鼠IFN-γ水平。

3 討論

接種豬瘟疫苗是防控豬瘟疫病流行暴發(fā)的重要手段，我國(guó)長(zhǎng)期采用全面接種豬瘟兔化弱毒疫苗來(lái)防控豬瘟，目前豬瘟在我國(guó)依然存在區(qū)域性散發(fā)情況，隨著隱性豬瘟感染病例逐年增多，迫使許多豬場(chǎng)采用加強(qiáng)免疫劑量及超前免疫的方式防控豬瘟，增加了豬場(chǎng)獸藥成本的同時(shí)免疫效果并不理想[11-12]。高瑩等[13]構(gòu)建的重組桿狀病毒rAc-HE2oKm 可分泌表達(dá)重組 E2 蛋白，分泌表達(dá)重組蛋白可以有效形成病毒樣顆粒， 制備疫苗免疫仔豬，可誘導(dǎo)免疫仔豬產(chǎn)生高水平抗體和中和抗體，該蛋白具有較好的免疫原性。張文杰等[14]（2007）、李文良（2013）等[15]利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)出高活性的重組E2蛋白，并且能夠分泌表達(dá)。Liu F X（2013）等[16]發(fā)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白，可高效表達(dá)外源基因并對(duì)外源蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后糖基化、磷酸化等修飾，E2蛋白產(chǎn)物與天然蛋白功能高度相似，免疫原性顯著優(yōu)于細(xì)菌、酵母表達(dá)體系。本研究利用昆蟲細(xì)胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)進(jìn)行豬瘟病毒 E2 蛋白表達(dá)，在制苗過程中加入免疫增效劑，分別在小鼠上開展了動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，并在免疫程序上設(shè)定為免疫一次，以期研究單次免疫添加增效劑疫苗對(duì)豬瘟E2蛋白特異性抗體的影響情況；對(duì)疫苗添加免疫增效劑的改良研究方向提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

Brown等[5]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白、小麥蛋白與酵母 β-葡聚糖組合后具有良好的免疫增強(qiáng)功效，其作用以提高細(xì)胞免疫及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力為主，以提高體液免疫及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性為輔。由于單一佐劑有其使用的局限性，因此現(xiàn)有疫苗中大多會(huì)添加兩種以上的佐劑組成佐劑系統(tǒng)[17]。本研究中復(fù)合增效劑由三種增效劑混合制成（MPL、MDP 和 β-葡聚糖配比為1：1：1）， 三種組分均有提高機(jī)體非特異性免疫的功效。非特異性免疫的激發(fā)是提高特異性免疫的基礎(chǔ)，抗原分子經(jīng)過巨噬細(xì)胞吞噬，并對(duì)抗原信息進(jìn)行遞呈，刺激免疫系統(tǒng)激發(fā)非特異性免疫，進(jìn)一步使B淋巴細(xì)胞活化﹑增殖﹑分化，從而增強(qiáng)了體液免疫中特異性抗體的水平。本研究結(jié)果表明，復(fù)合增效劑安全性良好，能顯著的激發(fā)特異性抗體的產(chǎn)生，可以作為豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗的增效劑添加組分。由于免疫增效劑種類繁多，不同的種類﹑組合方式﹑劑量配比都是影響疫苗安全性有效性的關(guān)鍵因素，因此免疫增效劑作為疫苗更新發(fā)展的方向之一，是一項(xiàng)值得不斷深入研究的課題。

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