非洲豬瘟病毒診斷方法研究進展

摘要：非洲豬瘟屬于我國的一類動物疫病，它是由非洲豬瘟病毒感染引起的導致豬伴發高死亡率的烈性動物傳染病之一。2018年8月，首次在我國的遼寧省沈陽市發現了ASF疫情。由于目前無有效疫苗，控制該病必須基于早期預防、檢測以及嚴格的生物安全措施。本文介紹了目前常用的非洲豬瘟病毒檢測方法，為快速和準確診斷非洲豬瘟提供了一定技術參考。

關鍵詞：非洲豬瘟；診斷方法；研究進展

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種死亡率接近100%的烈性動物傳染病。由于高發病率和死亡率以及缺乏有效的疫苗，該病原體對全球養豬業與國民經濟構成了嚴重威脅[1]。ASF是全球公認的一旦發現需立即上報世界動物衛生組織的烈性動物傳染病，我國將ASF劃分為一類動物疫病。

ASFV能代表整個病毒家族，且現階段發現的DNA蟲媒病毒只有ASFV，它是由基因組、核殼、內層衣殼和外層衣殼共同組成的二十面體病毒[1]。ASFV的基因組表觀是一個呈線性結構的DNA雙螺旋分子，其長度范圍在170～194kbp之間，該病毒基因組包含150多個開放閱讀框。ASFV復雜的病毒粒子組成、生命周期和免疫逃避機制給疫苗的開發帶來了巨大的困難。

ASF最早在1921年發生于肯尼亞[1]，ASFV最嚴重的傳播發生在2007年的格魯吉亞，從東非引進的國際餐飲垃圾中含有ASFV污染的肉類，導致ASF在整個歐洲和亞洲蔓延，對全球的養豬業造成了巨大損失。感染ASFV的豬及其制品、受污染的飼料、泔水、設施設備及工具等（包括運輸車輛、人員裝備、器具）均可成為傳染源。2018年，首次在我國的遼寧省沈陽市發現了ASF疫情[2]，隨后全國多地陸續發生了多起感染事件。

1 病毒分離法

Malmquist等科研人員于1960年用紅細胞吸附試驗檢測ASFV。該方法的設計理念是由于感染ASFV豬的帶毒紅細胞可吸附在豬的單核或者巨噬細胞的細胞膜表面，而這些攜帶感染的細胞能從體內含血液量較大的組織器官中大量獲得并分離，如脾臟、肝臟和淋巴結等。紅細胞吸附試驗作為檢查ASFV的有效手段，其檢測結果可作為具有決定性的診斷依據，但同時該方法也有一定的局限性，比如該試驗對實驗人員所需的技術手段要求甚高，耗費時間長，并且有一定可能出現呈假陰性的試驗結果，故該方法并未用作檢測ASFV的首選方法，通常作為其他ASFV檢測方法的補充[3]。

2 免疫學方法

根據被科研人員檢測的靶向目標的不同，免疫學方法檢測實際上分為兩大方向：其一針對ASFV抗原本身，其二針對機體對ASFV免疫應答后產生的抗體，因為在豬感染ASFV后的幾個月甚至幾年內，都能在感染ASFV的病豬的血液中檢測到ASFV的抗體，故可借助對抗體的檢測發現在ASF感染中幸存下來的豬。現階段科研人員已篩選出了ASFV結構蛋白中的19個區域作為免疫學方法檢測的目標靶點。

2.1 免疫熒光試驗

免疫熒光試驗可以細分為兩種，其一為熒光抗體試驗，其二為間接熒光抗體試驗，這兩種方法的不同主要在于被檢測的靶向目標是ASFV本身還是感染ASFV后產生的相應抗體。熒光抗體檢測方法的試驗原理是“攜帶”熒光標記的抗體能與相應抗原結合后形成發熒光的抗原抗體復合物，感染ASF豬的組織病理切片在顯微鏡下進行觀察可看到發熒光的復合物。間接熒光抗體試驗的研發原理是利用熒光標記抗ASFV抗體的抗體，而非直接熒光標記ASFV的抗體。

2.2 免疫印跡試驗

疑似帶毒的樣本經處理后經過凝膠電泳的分離，能使目標蛋白保留在印跡紙上，后續再結合類似免疫熒光抗體或間接熒光抗體后，可完成對ASFV的檢測或者針對其產生的相應抗體的檢測，即為免疫印跡試驗[4]。該方法檢測ASFV的特點主要表現為較高的敏感度和特異性，但免疫印跡試驗因其過程繁雜且對試驗的反應條件、試驗所需的設備和試驗人員的技術均要求甚高，使得該方法在實際檢測ASFV的過程中局限性強，限制了檢測的地點。

2.3 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA），其試驗原理是讓“攜帶”了酶分子的抗體與對應的抗原或抗體發生特異性反應，并且在底物溶液存在的情況下促使“攜帶”的酶發生化學反應，并產生不同顏色且深淺不一的液體。WOAH（世界動物衛生組織）將ELISA作為診斷ASF的首選血清學方法[5]。研究人員將在培養ASFV感染的細胞過程中產生的特異性高的胞質可溶性抗原篩選了出來，并作為用ELISA抗體檢測法檢測ASFV需要的包被抗原，該方法已被廣泛地應用于ASFV感染的早期階段檢測。

2.4 免疫層析試紙方法

膠體金免疫層析技術的原理是把膠體金作為示蹤的標志物，并利用抗原抗體反應來顯示標志物的技術。膠體金免疫層析法操作不僅簡單而且不需要任何儀器設備，很適合我國基層畜牧獸醫用來檢測排查ASF[6]。隨著相關科學技術的進步，免疫層析試紙方法檢測手段進一步優化，傳統的膠體金試紙法已不再具有優勢，夾心法應運而生。其原理是因為帶有顯色物質的抗體-抗原復合物在檢測線處被捕獲并在檢測線處顯色。檢測線在陽性時能捕獲帶有顯色物質的抗原-抗體復合物從而呈現出顏色，在陰性結果時是無法顯色的，也就是人們常見的“紅色雙杠即為陽性，紅色單杠即為陰性”。質控線可直接捕獲顯色粒子標記的抗體而顯色，若質控線不顯色則該試紙檢測結果為無效結果。

3 分子學方法檢測非洲豬瘟病毒

研究發現ASFV的全基因組大小在170～194kbp范圍間，擁有151～167個開放的閱讀框架，利用分子學方法對ASF進行檢測的第一步應優先確定在ASF全基因組中保持穩定但又能與其他相似進化關系相區別的基因序列，以該序列作為擴增檢查的母模板。故該方法需要反復進行驗證，保證可以檢測到所有的ASFV，且不會將結果誤判為其他關系較近的病毒[7]。

3.1 聚合酶鏈式反應檢測法

ASFV的實驗室診斷最常采用的方法即為聚合酶鏈式反應（PCR），其技術核心為針對檢測樣本找到特異性引物，并根據DNA或RNA的生成過程來進行目標基因片段的擴增。我國科研人員早在2009年就根據ASFV的結構蛋白基因vp73設計出了PCR診斷ASFV的特殊引物，而vp73基因也是世界動物衛生組織推薦的用來設計特殊引物的目標基因片段。PCR具有檢測靈敏和耗時短等優點，被廣泛地應用于ASFV的實驗室診斷，但該技術也存在一定的局限性，比如PCR在開蓋加引物時可能會引入微生物，造成試驗樣本的污染，出現假陽性結果。另外，用于試驗的樣本中若存在酶，可能也會影響ASFV的檢測結果，出現假陰性的結果。

3.2 熒光定量PCR檢測法

熒光定量PCR檢測法不光可以進行定性檢測還能進行定量，并且提高了PCR檢測的敏感性和特異性，優化了檢測的效率。熒光定量PCR的檢測推薦使用ASFV的B646L基因序列來進行擴增。熒光定量PCR技術在診斷ASFV時會比PCR技術更準確，2009年以后，我國也建立了ASFV的熒光PCR檢測方法，其靈敏度得到了極大的提升，最低能檢測出每微升含15個拷貝數的樣品，對樣本的采樣量進行了優化。2019年我國已開發出用熒光定量PCR檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，并成功注冊成為國家二類新獸藥。2020年12月發表的《非洲豬瘟診斷技術》將ASFV的vp72基因作為目標擴增基因，優化了熒光定量PCR方法檢測ASFV的技術[7]。

3.3 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術是在普通PCR技術上進行了優化，試驗過程均在60～65℃的溫度下進行，并在短時間內完成目標基因的擴增，通常在1h內，是一種更為簡便、快速、精確和花費成本更低的檢測方法。2019年，利用環介導等溫擴增技術檢測ASFV的試劑盒成功面市，并成為第一個成功用該技術注冊ASFV檢測的試劑盒[7]。

3.4 重組酶介導等溫核酸擴增技術

重組酶介導等溫核酸擴增技術在近年來愈發受歡迎，該方法利用了細菌或真菌產生的重組酶，這些酶相比噬菌體產生的重組酶更易獲得且對試驗溫度的變化具有更強的適應性。如今，我國在運用該技術檢測ASFV時，推薦選用B646L作為目標基因序列，并采取熒光標記的探針追蹤該目標基因序列進行ASFV的檢測。

3.5 微流控芯片檢測法

微流控芯片技術是于1990年左右提出的一種借助微米級通道來操控微液滴流動的技術，但隨著科學技術的發展，目前被科研人員用來與光學傳感技術相融合，達到檢測病原微生物的目的。該方法被推薦用于ASFV的檢測，并在2021年7月被納入了出入境檢疫行業標準，推薦選用的目標基因序列為Vp72基因，特異性的引物被固定后裝在芯片反應室，后續會與核酸模板和熒光染料充分混合，利用具有離心功能和恒溫功能的微流控芯片檢測儀來達到檢測ASFV的目的[7]。

4 結語

非洲豬瘟疫情自2018年在我國肆虐以來，對我國的養豬業造成了巨大損失，但ASFV的檢測技術由此發生了巨大改變，取得了非常大的進展。本文提及的檢測非洲豬瘟病毒的方法都具有其優勢，但同時也都具有一定的局限性，故具體的檢查手段應結合實際的需要來進行選擇。此外，科研人員在保證準確性和靈敏度的情況下應盡可能地研發出更高效的檢測方式，提高檢測限度，做到即時診斷。

參考文獻：

[1] Li Z， Chen W， Qiu Z， et al. African Swine Fever Virus： A Review. Life （Basel）， 2022（8）：1255.

[2] 陳騰，張守峰，周鑫韜，等.我國首次非洲豬瘟疫情的發現和流行分析[J].中國獸醫學報，2018，38（9）：1831-1832.

[3] 楊湛森，蔣雅楠，程楠，等.非洲豬瘟病毒檢測方法的研究進展[J].分析測試學報，2021，40（5）：628-638.

[4] Pastor MJ， Laviada M D， Sanchez-vizcal-nojm， et al. Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay[J]. Can J Vet Res， 1989， 53（1）：105-107.

[5] 張路捷，高雁怩，夏婷婷，等．非洲豬瘟病毒p72蛋白阻斷ELISA檢測方法的建立[J].畜牧獸醫學報，2022，53（5）：1509-1516.

[6] 劉濤，李永秀，康亞男，等.非洲豬瘟病毒檢測技術研究進展[J].豬病防控， 2021（5）：57-62.

[7] 莊金秋，梅建國，謝金文，等.非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展[J].飼料與畜牧，2017（22）：32-36.