一株豬細小病毒的分離鑒定

摘要：2020年從黑龍江省某豬場的流產胎兒采集病料，經預處理后，接種豬腎原代細胞，能產生明顯的致細胞病變作用。經過血凝活性、病毒含量、熒光抗體檢查、電鏡觀察、分子生物學等項測定，證明分離的病毒為豬細小病毒（PPV）。該病毒的HA效價≥1：256，TCID50≥107.0，呈PPV特異性熒光，電鏡觀察到呈六角形或圓形、無囊膜、直徑20 nm左右的病毒粒子，可以被PPV特異性抗血清中和，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，出現一條445 bp特異性電泳條帶，并與7909株相符。對其進行了VP2基因克隆和測序，序列分析表明，VP2基因片段與其它PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。其與NADL-2株和China株的親緣關系最近。毒株耐熱，對胰蛋白酶有抵抗力，對乙醚、氯仿不敏感，pH 3～9，病毒穩定，該毒株純凈，無外源病毒污染。本研究為該病疫苗的研發奠定了基礎。

關鍵詞：豬細小病毒；分離；鑒定

豬細小病毒感染是引起母豬繁殖障礙的原因之一，很早就被世界各國所證明[1，2]，1983年，我國在上海首次發現豬細小病毒感染，并進行了病毒的分離和鑒定[3]，后來侯世寬等[4] 和李寶啟等[5]也報道在吉林和黑龍江分離到豬細小病毒。目前在我國已有較多豬場存在該病。本病病原屬于細小病毒科（parvoviridae）細小病毒屬（parvovirus）。豬是豬細小病毒的唯一宿主，感染帶毒豬是本病的主要傳染源，任何生長階段的豬均可感染本病毒，初產母豬和未免疫的妊娠母豬最易感，生長豬或種豬感染后無明顯外觀癥狀，但可通過消化道、呼吸道等持續排毒，并可垂直傳播[6]。豬細小病毒感染有一定的季節性，多發生在每年4—10月份，如果免疫不到位，預防措施不當，圈舍消毒不嚴格等，易造成細小病毒在種群中的快速傳播，給豬場繁殖生產造成極大損失[7]。

本研究從黑龍江省某地分離獲得一株疑似豬細小病毒，經過致細胞病變作用觀察、免疫熒光試驗、電鏡觀察、病毒PCR檢查及病毒VP2基因的序列分析和病毒特異性檢查等，確定該分離毒株為豬細小病毒。試驗進行了該毒株的純凈檢查、污染外源病毒檢查、病毒血凝活性、病毒含量、熱敏感性試驗、胰蛋白酶敏感性試驗、乙醚敏感試驗、氯仿敏感試驗、耐酸性試驗等。鑒定該病毒株的生物學特性及血清學特性，為該病疫苗的研發奠定了基礎。

1 材料

1.1樣品來源

10份豬病料樣本，采自黑龍江省某地豬場流產胎兒。

1.2主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術有限公司；熒光定量試劑盒、pMD18-T載體，寶生物工程（大連）有限公司產品；1%雞細胞懸浮液，由哈藥集團生物疫苗有限公司質量管理制備保存；PBS溶液，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心制備保存；其他試劑均為國產分析純。

1.3引物設計

引物序列為：上游引物P1：5'-CAGAATCAGCAACCTCAC-3'；下游引物P2：5'-TGGTCT CCTTCTGTGGTAGG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

2方法

2.1 病料的采集與分離

2020年黑龍江省某地豬場，數頭初產母豬發生流產，死產，胎兒呈干尸化。取回胎兒，無菌采集胎兒肝、腸系膜淋巴結、腎、腦等組織。以1：10加入滅菌生理鹽水，研磨，制備組織懸液，經反復3次凍融后，2 000 r/min離心15 min，收集上清液，再經0.2 μm濾膜濾器過濾，將濾出液置-30 ℃冰箱凍結保存，供分離病毒。

2.2 病毒的鑒定

1）紅細胞凝集試驗（微量法）。按現行《中國獸藥典》方法進行，以出現完全凝集的病毒最大稀疏度為該樣品的效價。

2）病毒含量（TCID50）測定。按《中國獸藥典》方法進行。按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

3）病毒的純凈性檢查。按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。

4）免疫熒光法檢查。取已培養24 h的ST細胞蓋玻片培養物，接種病毒，再經24 h培養。取出蓋玻片，用PBS沖洗，經丙酮固定，再用豬細小病毒熒光抗體濕盒內染色30 min，沖洗，封固，鏡檢。

5）病毒的電鏡觀察。將處理后的樣本送到哈爾濱獸醫研究所電鏡室完成。

6）病毒的分子生物學鑒定

①PCR檢測。收獲的含毒細胞培養液經3次凍融后，離心取上清液，用試劑盒提取病毒DNA。擴增細小病毒基因中VP2基因內的461～905 bp的基因片段。

PCR反應體系總體積50 μL（DNA：3 μL；上游引物：1 μL；下游引物：1 μL；PCR buffer：5 μL；dNTP：4 μL；Taq酶：0.5 μL；水：35.5 μL）；PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，進入循環，94 ℃變性，1 min；47.9 ℃退火，1 min；72 ℃延伸，1 min；30個循環后，72 ℃，延伸10 min，4 ℃終止循環。

②VP2基因序列測定。將PCR純化產物與pMD18-T載體16 ℃連接過夜。連接產物轉化感受態細胞TGⅠ，涂布在含Amp的固體LB平板，待長出菌落后，挑取疑似菌落于含Amp的液體LB培養基中擴增，堿裂解法小劑量提取重組質粒。重組質粒分別用BamHⅠ單酶切、BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組子命名為pMD18-T-VP2。并送上海生物工程公司進行測序。將測序結果與NADL-2株、Kresses株及國內的毒株SD-68株、LJL12株、SR-1株和China株的VP2基因片段進行核苷酸和氨基酸序列的比較和分析。

7）病毒特異性檢查。取200 TCID50含毒細胞培養液，與等量的7909株豬細小病毒抗血清混合，置37 ℃作用1 h，然后以紅細胞凝集試驗測定其血凝活性。另外，將經抗血清作用的病毒液，接種尚未形成單層的ST傳代細胞上，置37 ℃培養3～6 d，每日觀察記錄致細胞病變作用（CPE）。

8）病毒的理化特性測定。將分離的病毒在56 ℃作用48 h、在70 ℃作用2 h、在80 ℃作用5 min，同時將病毒分別胰蛋白酶、pH3.0、pH 9.0、乙醚、氯仿中作用1 h，同時設立對照組，然后分別測定TCID50和檢測血凝活性。

3 結果評估

3.1 "豬細小病毒的分離

當細胞出現典型細胞病變：細胞固縮，突立聚集，顆粒增多，有的細胞間融合，細胞脫落，出現空斑，病變如圖1。

3.2 "病毒鑒定

1）病毒的血凝活性 取不同代次的含毒細胞培養液測定對豚鼠紅細胞的血凝活性，檢測的結果見表1。收獲的含毒細胞培養液能凝集豚鼠紅細胞，具有較高的血凝活性，而且隨著傳代培養代次的增加，病毒對細胞的適應性增強，致使病毒的血凝價有一定的提高。

2）病毒含量（TCID50）測定結果 選擇3個批次含毒細胞培養液，測定病毒的含量（TCID50），結果見表2。分離病毒的含量為TCID50≥107.0。

3）病毒純凈性檢查結果 按照現行《中國獸藥典》進行無菌檢驗，結果無細菌、霉菌、支原體及外源病毒。

4）免疫熒光試驗結果 在細胞核和細胞質中，可見呈蘋果綠色的特異性熒光，陰性對照無特異性熒光出現，見圖2。

5）病毒的電鏡檢查結果。觀察到外觀呈六角形或圓形，無囊膜的病毒粒子，直徑約為20 nm（見圖3）。

6）病毒的分子生物學鑒定

①PCR檢查結果。PCR產物的檢測，取2 μL PCR產物加入溴酚藍指示劑，于混有EB的0.8%瓊脂糖凝膠上80 V/25mA電泳10～20 min，當溴酚藍電泳至適當位置，紫外燈下觀察，結果如圖4。

圖中4、5泳道分別為PPV國家標準株7909株和本實驗分離的H株，均擴增出了與實驗設計相符的445 bp電泳條帶。而正常的ST細胞對照和豬偽狂犬病毒（PRV）中均未擴增出相應的電泳條帶。

②病毒VP2基因的克隆及序列測定結果 PPV H株VP2基因片段的PCR擴增結果：以提取的PPV H株的DNA為模板，擴增出1條1 600 bp的目的片段，與預期結果相符，純化后得到1 600 bp的VP2基因片段，如圖5所示。

VP2基因片段的克隆與酶切鑒定：純化產物（1 600 bp）與pMD18-T（2 692 bp）載體連接、轉化，擴增培養后得到重組子，經BamHⅠ單酶切得到約4 300 bp的片段，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到約1 600 bp的片段和2 700 bp的片段，與預期結果相符，如圖6所示。

VP2基因片段測序結果：測序結果得到了與預期結果相符的1 600 bp的基因片段，其中包括PPV VP1基因的2個核苷酸和VP2基因的1 598個核苷酸，編碼PPV VP2基因的532個氨基酸。測序結果見圖7。

VP2基因片段序列分析：利用DNA MAN軟件對H株VP2基因片段進行序列分析， 結果如表3所示。表明H株與其他PPV毒株的核苷酸同源性均在99%以上，其中與NADL-2（4973）株的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列的同源性最高，僅有3個核苷酸差異即T-276-G，C-277-T，T-961-C；和2個氨基酸的差異，即S-92-V，I-320-T。

結果證實此分離的病毒為豬細小病毒，并且與國際毒株和國內分離毒株的核苷酸同源性均在99%以上，證實H株與國內流行毒株之間的同源性極為接近。

系統進化樹分析：H株和其它幾株PPV VP2的進化樹分析表明，H株與NADL-2株和China株的遺傳距離最近（見圖 8）。

7）病毒的特異性檢查結果。

取H株的病毒培養液與等量7909抗血清混合作用后，結果血凝活性喪失。接種ST細胞不產生細胞病變。

8）病毒的理化特性測定。

4 "討論

采集的流產胎兒病料，經過處理后，以10%接種尚未形成單層的豬腎原代細胞，經37 ℃培養觀察，結果出現CPE，表明病毒在細胞中已經增殖。測定收獲的含毒細胞培養液，對豚鼠紅細胞具有凝集活性，經幾代傳代培養適應后，血凝價≥1：256。以豬細小病毒免疫熒光法檢查病毒液的蓋玻片培養物，呈現豬細小病毒特異性熒光。病毒液的病毒含量（TCID50）可達到107.0。免疫電鏡檢查，可在細胞核內觀察到外觀呈六角形或圓形，無囊膜，直徑約為20 nm的病毒粒子，以PCR檢查含毒細胞培養液，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，出現一條445 bp的特異性電泳條帶，并與7909株相符。對分離病毒進行了VP2基因克隆和測序，結果分離病毒與其他豬細小病毒毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。該分離病毒能被豬細小病毒特異性抗血清所中和。經過上述一系列的試驗，證明分離毒株為豬細小病毒。分離毒株與其他幾株豬細小病毒VP2的進化樹分析表明，分離毒株與NADL-2株和China株的遺傳距離最近。分離病毒經過檢測表明，病毒耐熱，80 ℃作用5 min，病毒失活和喪失血凝活性。70 ℃作用2 h，其血凝價及TCID50有所下降。對胰蛋白酶有抵抗力。其對酯溶劑氯仿和乙醚不敏感。病毒在pH 3～9，穩定，血凝價和病毒含量不下降。這些理化特性與資料中[8]記載的相同。

5 結論

2020年從黑龍江省某豬場的流產仔豬病料中，經豬腎原代細胞培養，分離出一株病毒，該毒株具有CPE作用，能凝集豚鼠紅細胞；分離毒株蓋玻片培養物，經豬細小病毒熒光抗體染色，呈現豬細小病毒特異性熒光；于電鏡下觀察，可見外觀呈六角形或圓形、無囊膜、直徑20 nm左右的病毒粒子，利用針對豬細小病毒VP2基因的引物，應用PCR方法進行檢驗，特異性片段大小為445 bp，并與國家標準株7909株擴增產物具有相應的電泳條帶；對其進行了VP2基因克隆和測序，序列分析表明，H株VP2基因片段與其它PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。其與NADL-2株及China株的親緣關系最近。另外，分離的H株病毒能被7909株豬細小病毒特異抗血清中和。分離的H株豬細小病毒的紅細胞凝集（HA）效價≥1：256，病毒含量為≥107 TCID50。病毒純凈、無細菌、霉菌及支原體污染。病毒耐熱，在70 ℃作用2 h，病毒滴度下降，80 ℃作用5 min，病毒失活。對胰蛋白酶有很強抵抗力。對乙醚、氯仿不敏感。耐酸范圍大，pH "3～9，經90 min作用仍穩定。該分離毒株具有良好的生物學及血清學特性。

參考文獻：

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