醋紅大戟的質量標準研究
2023-12-29 00:00:00陳曦高燕王楊海賈明倩張悅馬露蘭趙渤年
山東科學 2023年4期
摘要：對醋紅大戟的質量標準進行全面研究，為制定該品種的《山東省中藥飲片炮制規范》標準提供技術支撐。在《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版醋紅大戟質量標準的基礎上，收集紅大戟樣品29批次，醋制加工后，對醋紅大戟的性狀、水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、顯微、薄層、含量測定進行了系統研究和分析，制定相關限度。在原有標準基礎上增加了顯微鑒別項、蘆西定含量測定項，修訂了浸出物項，完善了該飲片的質量標準。該研究確定了醋紅大戟的質量控制指標，所建立的質量控制方法操作方便、重復性好、結果準確，可用于控制醋紅大戟的質量。
關鍵詞：醋紅大戟；鑒別；質量標準；蘆西定；含量測定
中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0018-11
開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：
Study on the quality standard of vinegar-processed Knoxiae Radix
CHEN Xia，GAO Yanb，WANG Yanghaia，JIA Mingqiana，ZHANG Yuea，MA Lulana，ZHAO Bonianb*
（a.School of Pharmacy; b.Innovation Institute of Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）
Abstract∶The study aimed to conduct a comprehensive study on the quality requirements for Knoxiae Radix processed with vinegar and to offer technical support for the formulation of the standard of Shandong Province Chinese herbal medicine processing specification. On the basis of the quality standard of vinegar-processed Knoxiae Radix in Shandong Province Chinese herbal medicine processing specification （2012）， 29 batches of Knoxiae Radix samples were collected. Following vinegar processing， the parameters including characteristics， moisture， total ash， acid insoluble ash， alcohol soluble extract content， microscopic， and thin layer and content determination were systematically studied and analyzed and the relevant limits were formulated. The project was established on the basis of the current quality standard， in which the microscopic identification， and the lucidin content determination were added， and the extractum item were revised when compared with current quality standard. This study established the Knoxiae Radix quality control index after vinegar processing. The established method of quality control is simple， reproducible， and accurate which can be used for quality control of vinegar-processed Knoxiae Radix.
Key words∶vinegar-processed Knoxiae Radix; identification; quality standard; lucidin; content determination
紅大戟為茜草科紅芽大戟屬多年生直立草本植物，藥用部位為地下塊根，始載于宋代《小兒藥證直訣》，主治胸腹積水、痰飲喘滿、水腫腹脹、二便不利等［1］。臨床上用于治療癰腫瘡毒，瘰病痰核等癥［2］。紅大戟主要含有蒽醌類與以三萜類為代表的非蒽醌類化合物，文獻報道蒽醌類色素蘆西定及其苷具有遺傳毒性［3］。醋炙后可使有毒成分含量降低，達到解毒作用［4］。
毒性中藥的安全有效性備受關注，在臨床使用中毒性中藥主要通過炮制減毒保證其臨床應用安全性。中藥飲片炮制是毒性中藥有效的減毒途徑，在得到良好療效的同時最大程度地降低毒性是毒性中藥炮制的主要目的，基于毒性飲片臨床應用安全有效的原則，對毒性飲片進行有效質量控制必不可少［5］。
早在《中國藥典》1963年版一部就收載有紅大戟，在該品種的“炮炙”項下，列有“紅大戟”和“醋大戟”兩種飲片，并有“一般炮炙后用”的規定［6］。在1977年版、1985年版、2005年版、2010年版、2015年版、2020年版《中國藥典》中“炮制”項下均沒有收載醋炙紅大戟炮制規格及相關規定［7-8］。但從2010年版《中國藥典》開始在“用法與用量”中規定“內服醋制用，外用適量，生用”［9］。目前，醋紅大戟質量標準缺乏對其毒性控制的指標，這可能會影響醋紅大戟質量的穩定性、可控性及臨床用藥的合理性、安全性、有效性，因此醋紅大戟的質量標準問題不容忽視，建立專屬性的質量標準是控制其質量的前提，也是保障其臨床應用安全有效的必要條件，因此建立標準顯得尤為迫切。
本研究在《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版醋紅大戟質量標準［10］的基礎上，參照2020年版《中國藥典》紅大戟項下相關內容［11］，對醋紅大戟的性狀、水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、顯微、薄層進行分析，采用高效液相色譜法（HPLC）法，測定醋紅大戟中蘆西定含量并規定含量限度，對醋紅大戟炮制規范標準進行了完善和提高，增加了顯微鑒別項，修訂浸出物項，增加蘆西定含量測定，為其制定合理限度，建立了飲片質量標準，以有效控制、提高該品種的質量，為全面控制醋紅大戟質量提供科學依據。
1 儀器與材料
1.1 實驗儀器
儀器：Wooking K2025高效液相色譜儀（山東悟空儀器有限公司），Wooking K2025 UVD紫外-可見光檢測器（山東悟空儀器有限公司），METTLER AE240電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。
色譜柱：Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（賽默飛世爾科技有限公司）。
1.2 實驗材料
薄層板：預制硅膠G板，厚度0.20～0.25 mm，面積200 mm×200 mm（青島海洋化工有限公司）。
展開劑：石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（體積比15：5：1）的上層溶液，15 mL。
顯色劑：氨蒸氣。
試劑：甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
對照品：蘆西定對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111960-201301）。
樣品：紅大戟藥材主產于云南、廣西、廣東等省，從全國范圍內收集紅大戟藥材29批，經山東省中醫藥研究院林慧彬研究員鑒定均為茜草科植物紅大戟Knoxia roxburghii（Spreng.）M.A.RAU的干燥塊根。藥材來源信息詳見OSID科學數據與內容附表1。
2 方法與結果
經相關炮制規范及專著查實表明，紅大戟以凈制為多，炮制工藝以醋制應用最多［12］，因此選擇以醋制法炮制紅大戟。
2.1 炮制方法
按照《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版“紅大戟”項下醋紅大戟炮制方法，將干燥凈紅大戟置于鍋內，加入米醋和適量水，浸潤1～2 h，文火加熱共煮至透，醋液被吸盡時，取出，晾涼后，切厚片，干燥。每1 kg紅大戟用米醋0.2 kg。
2.2 性狀
對收集并炮制后的1～10批醋紅大戟飲片進行性狀觀察，與《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版中醋紅大戟項下的規定一致。
2.3 鑒別
2.3.1 顯微鑒別
醋紅大戟粉末紅棕色，黏液細胞中有散在或成束的草酸鈣針晶，長度50～153 μm。具緣紋孔為主要導管類型，直徑12～74 μm。木纖維長梭形，多成束，直徑16～24 μm，紋孔口人字狀或斜裂縫狀。木栓細胞微木化，表面觀呈類多角形或類長方形，可觀察到部分細胞中充滿紅棕色或棕色物。色素塊淡黃色、棕黃色或紅棕色。醋紅大戟樣品1粉末的顯微圖如圖1所示，樣品2～10見OSID科學數據與內容附圖1。
2.3.2 理化鑒別
參考《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版醋紅大戟項下相關規定，對10批醋紅大戟樣品進行理化反應鑒別，結果顯色清晰，與2012年版炮制規范中醋紅大戟項下的規定一致。
2.3.3 薄層鑒別
參考《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版醋紅大戟項下相關規定，根據薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502薄層色譜法）試驗，對1～10批醋紅大戟樣品進行薄層鑒別，結果顯示薄層板上斑點清晰，分離情況較好，Rf值適中。具體操作如下。
供試品溶液的制備：取本品粉末3 g，加入甲醇30 mL浸漬1 h，過濾，蒸干濾液，殘渣加水10 mL溶解，加入鹽酸1 mL，加熱回流30 min后立即冷卻，用CHCl3振蕩提取2次，每次加入20 mL，合并提取后的CHCl3溶液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL溶解，即得供試品溶液。
對照藥材溶液的制備：取紅大戟的對照藥材3 g，同法制備對照藥材溶液。薄層板：預制硅膠G板，厚度0.20～0.25 mm，面積200 mm×200 mm，青島海洋化工有限公司制造。點樣：采用專用毛細管接觸法點樣，供試品溶液與對照藥材溶液點樣量各5 μL。展開劑：石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（體積比15：5：1）上層溶液，取15 mL。顯色劑：氨蒸氣。展開方式：雙槽展開缸（22.9 cm×22.0 cm），展開缸與薄層板預飽和30 min后上行展開10 cm。檢視：可見光下。結果：在供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。
試驗過程中，記錄實驗室環境，發現本試驗對溫、濕度要求不高，因此未對溫、濕度進行規定。
2.4 檢查
2.4.1 水分
采用《中國藥典》2020年版（四部）通則0832水分測定法第二法對10批醋紅大戟樣品進行水分測定，測定結果見表1。各批醋紅大戟樣品水分測定結果在5.98%～9.28%范圍內，平均值為8.50%，符合《中國藥典》及《山東省中藥飲片炮制規范》的規定。
2.4.2 總灰分
采用《中國藥典》2020年版（四部）通則2302灰分測定法項下的總灰分測定法，對10批醋紅大戟樣品進行總灰分測定，測定結果見表1。各批醋紅大戟樣品總灰分測定結果在11.22%～14.51%范圍內，平均值為12.32%。根據測定結果，符合《中國藥典》及《山東省中藥飲片炮制規范》的規定。
2.4.3 酸不溶性灰分
采用《中國藥典》2020年版（四部）通則2302灰分測定法項下的酸不溶性灰分測定法，對10批醋紅大戟樣品進行酸不溶性灰分測定，測定結果見表1。各批醋紅大戟樣品的酸不溶性灰分測定結果在1.47%～2.70%范圍內，平均為2.12%，符合《中國藥典》及《山東省中藥飲片炮制規范》的規定。
2.4.4 浸出物
根據醇溶性浸出物《中國藥典》2020年版（四部）通則2201項下的熱浸法，對10批醋紅大戟樣品進行了測定，測定結果見表1。各批醋紅大戟樣品的醇溶性浸出物測定結果在45.80%～52.74%范圍內，平均值為50.17%，符合《山東省中藥飲片炮制規范》的規定。
2.5 蘆西定含量測定
根據《中國藥典》2020年版（一部）紅大戟品種項下蘆西定的含量測定方法，按照《中國藥典》2020年版（四部）通則0512高效液相色譜法測定10批醋紅大戟樣品中蘆西定的含量。
2.5.1 色譜條件與系統適用性試驗
填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠。流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液（體積比60∶40）。檢測波長：280 nm。理論板數：按蘆西定峰計算應不低于3 000。柱溫：28 ℃。流速：1.0 mL/min。
按上述色譜條件進行試驗，色譜峰分離條件較好，見圖3。
2.5.2 對照品溶液的制備
取蘆西定對照品適量，精密稱定后加入甲醇超聲處理，溶解制成每1 mL含蘆西定125 μg的溶液，用作對照品儲備液；取適量的對照品儲備液，加入甲醇稀釋成每1 mL含蘆西定50 μg的溶液，用作對照品溶液。
2.5.3 供試品溶液的制備
取過四號篩的本品粉末約1 g，精密稱定，放置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）1 h后放冷，再稱定質量，用甲醇補足失重，搖勻后過濾，取續濾液，即得供試品溶液。
2.5.4 方法學考察
2.5.4.1 線性關系考察
基于2.5.1的色譜條件，考察蘆西定對照品的線性關系。取2.5.2項下的對照品儲備液（125 μg/mL），制備成質量濃度為0.025、0.062、0.125、0.188、0.250、0.375 μg/mL的對照品溶液，注入高效液體色譜儀，分別測定峰面積。以蘆西定對照品的樣本量為橫軸，峰值面積值為縱軸，進行線性回歸分析，得到回歸方程。其結果如表2、圖4所示。回歸方程y=6 418.70x-626.51，相關系數R2=0.999 9。實驗結果表明，蘆西定進樣量為0.25～3.75 μg與峰面積有良好的線性相關。
2.5.4.2 精密度試驗
取2.5.3項下制備的供試品溶液（醋紅大戟樣品3號）20 μL，注入高效液相色譜儀，連續6次進樣，測定蘆西定的峰面積，計算相對標準偏差δRSD為0.29%，結果見表3。結果顯示該儀器精密度良好。
2.5.4.3 穩定性試驗
為觀察供試品溶液在檢測過程中其待測成分的穩定性，取醋紅大戟樣品（3號），按照2.5.3項下的制備方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h精密吸取20 μL的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定蘆西定的峰面積。計算δRSD值為0.45%，結果見表4。結果顯示，24 h內供試品溶液的穩定性良好，滿足測定的需要。
2.5.4.4 重復性試驗
取醋紅大戟樣品（3號），根據供試品溶液的制備方法，平行制備6份，根據上述方法和條件進行測定，計算每份供試品的含量。計算δRSD值為1.01%，結果見表5。結果顯示，測定本品含量的方法重復性良好。
2.5.4.5 加樣回收率
取已知含量的醋紅大戟樣品（9號）0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，取6份，在每一份樣品中精密加入蘆西定對照品溶液1 mL（0.312 5 mg/mL），再精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）1 h，冷卻后再次稱定質量，用甲醇補足失重后搖勻過濾，取續濾液，即得。根據上述方法進行測定，計算回收率。計算得平均回收率為99.16%，δRSD值為1.07%，結果見表6。結果顯示，該測定方法回收率良好。
2.5.4.6 樣品測定
基于《中國藥典》2020年版（四部）通則0512高效液相色譜法測定項下的方法和條件，對序號為1～10的10批樣品醋制前后的蘆西定含量進行測定，測定結果見表7～8。10批紅大戟中蘆西定質量分數為0.06%～0.18%，平均值為0.10%。均符合《中國藥典》2020年版“紅大戟”含量測定項下的限度規定，醋制后10批醋紅大戟樣品蘆西定的質量分數為0.06%～0.31%，平均值為0.14%。根據各批樣品的測定結果，結合《中國藥典》2020年版“紅大戟”質量分數測定項下的限度規定，規定本品按干燥品計算，蘆西定（C15H10O5）質量分數為0.04%～0.35%。
2.6 結果
2002年，國際癌癥研究機構報告蘆西定具有致癌性。此后，日本對其進行安全性評價，確認此種成分具有遺傳毒性和致癌性，因此有必要對醋紅大戟中蘆西定的限度進行控制，從而保障其質量的穩定性、可控性及臨床用藥的安全性。通過對10批醋紅大戟樣品中蘆西定的含量測定結果發現，紅大戟經醋制后蘆西定的含量有增加有降低，為進一步尋找其規律性，我們對收集的剩余19批樣品分別進行醋制加工，針對其醋制前后蘆西定的含量進行了測定，結果見OSID科學數據與內容附表2、3。
2.7 蘆西定質量分數測定結論
分析上述結果可知，29批紅大戟經醋制后，17個批次的蘆西定質量分數均降低，12個批次的蘆西定質量分數增加，見圖5，最高可增加12倍之多。
3 討論與結論
針對大戟屬藥用植物的毒性，歷來臨床多用炮制品，通過不同炮制方法，減少其毒性成分，緩和其瀉下等毒性表現，更好地為臨床服務。大戟屬植物炮制方法多種多樣，不同書籍記載均有所不同，其共同點為加熱和醋泡。醋性溫、具殺邪毒收斂之功，多用于峻下逐水類藥物的炮制，如大戟、狼毒等，經醋制后，使藥性緩和，可明顯降低藥物對消化道的強烈刺激性［13］，降低其刺激性成分的含量，從而達到減毒適效的目的［14］，提高用藥的安全性。
通過對醋制前后蘆西定的質量分數測定結果可知，不同批次的紅大戟之間蘆西定質量分數有明顯的差異，29批紅大戟經醋制后，17個批次的蘆西定質量分數均降低，但蘆西定質量分數仍有增加的風險，分析原因可能是因為醋制工藝等不確定的因素引起醋紅大戟中蘆西定成分增加，需進一步對炮制工藝進行深入研究，探討蘆西定質量分數變化的影響因素，規范炮制工藝，保證其安全性。
在2020版《中國藥典》（一部）紅大戟項下規定，3-羥基巴戟醌和蘆西定作為含量測定的指標，但前期對收集的29批樣品按照《中國藥典》規定進行了3-羥基巴戟醌的質量分數測定，結果收集到的29批樣品中25批均低于《中國藥典》2020年版“紅大戟”質量分數測定項下3-羥基巴戟醌不得少于0.030%的規定，因此未對樣品中3-羥基巴戟醌質量分數再進行測定。
根據文獻報道發現紅大戟中蒽醌類的質量分數普遍較低［15］，分析原因可能是因為蒽醌類化合物的次生代謝合成途徑主要為聚酮途徑和莽草酸路徑，光照、海拔、土壤、種屬等因素容易影響蒽醌類成分的生物合成，適宜的生態環境會影響優質藥材的形成以及藥材中功效成分的合成與積累［16］。紅大戟中的蒽醌類成分還會因炮制時間、火候不同受到影響，使其出現程度不同的改變。隨著炮制時間的不斷增加，蒽醌成分的含量會明顯減少，可能是蒽醌成分所存在的熱不穩定性特點而造成的［17］。炮制后，不僅蒽醌類的成分會發生改變，還會出現復雜性的化學改變，進而引發藥性和療效變化［18］。因此需要深度分析研究紅大戟在不同的光照、海拔、土壤等環境下對其3-羥基巴戟醌含量的影響，最大限度減少紅大戟中主要功效成分3-羥基巴戟醌的流失情況，提高該中藥有效成分的含量，保證紅大戟的品質及臨床用藥的有效性。
同時需要進一步規范紅大戟的炮制工藝，對關鍵控制節點的量質傳遞過程需要開展深入研究，規范統一炮制工藝參數，控制蘆西定含量的同時減少紅大戟中3-羥基巴戟醌的成分流失，減毒增效，保證臨床療效。
由以上結果可知紅大戟經過炮制成為醋紅大戟后，其水分含量有所提高、總灰分及酸不溶性灰分含量有所下降，浸出物含量有所增加，故對《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版所收載的醋紅大戟質量標準提出以下建議：增加顯微鑒別項；修訂浸出物檢查項，暫定本品醇溶性浸出物質量分數不得少于45.0％；增加含量測定項，根據各批樣品的測定結果，規定本品按干燥品計算，蘆西定（C15H10O5）質量分數應為0.04%～0.35%。
綜上所述，醋紅大戟原質量標準相對簡單，主要以性狀、薄層鑒別、浸出物檢查等作為質量控制指標，不能滿足質量控制的需要，無法確保其質量的可控及臨床療效。因此，我們根據收集的醋紅大戟樣品，在2012年版《山東省中藥飲片炮制規范》質量標準基礎上，增加顯微鑒別項，修訂浸出物檢查項，增加藥材中蘆西定的含量測定項，同時規定了藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物及指標成分含量的檢測限度，完善了質量標準，使醋紅大戟質量能夠得到全面有效的控制，可為其質量控制提供參考依據。
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