內生促生細菌對毛竹幼苗生長特性及酶活性的影響

摘 要：為探討內生促生細菌產氣腸桿菌CT-B09-2、解淀粉芽孢桿菌JL-B06、乙酸鈣不動桿菌WYS-A01-1對毛竹幼苗的生長和相關酶活性的影響，本研究針對毛竹幼苗分別接種內生促生細菌后，采用分光光度計法測定幼苗葉片POD、SOD、CAT和MDA含量，同時測定接種菌液后幼苗株高、根長、根鮮重等表型性狀，分析內生促生細菌對毛竹幼苗生長的影響。結果表明：接種單菌菌液中，產氣腸桿菌CT-B09-2對毛竹幼苗株高提升效果顯著，與對照組相比，株高提高34.2 %；解淀粉芽孢桿菌JL-B06對幼苗根鮮重提升顯著，相對提高66.67 %，對于過氧化氫酶類的活性促進作用最優菌株為產氣腸桿菌CT-B09-2；復合菌液處理中，比例為1：2：1的處理對株高提升效果最佳，提高36.10 %；比例為2：1：1的處理對根長和根鮮重促生效果最優，分別提高44.78 %、70.59 %；對于葉片細胞過氧化氫酶類的活性促進作用最優比例為1：1：2。三株內生細菌均對毛竹幼苗的生長和葉片酶活性有促進作用，且復合菌液促生效果更優。

關鍵詞：內生細菌；促生；毛竹；生長特性；酶活性

Abstract：To investigate the effects of endophytic growth-promoting bacteria Enterobacter aerogenes CT-B09-2， Bacillus amyloliquefaciens JL-B06 and Acinetobacter calcoaceticus WYS-A01-1 on the growth and leaf related enzyme activities of Phyllostachys edulis seedlings， in this study， after inoculation with endophytic grown-promoting bacteria， the activities of POD， SOD and CAT enzymes and the content of MDA in the leaves of P. edulis seedlings were determined by spectrophotometer. The plant height， root length， root fresh weight and other phenotypic characters of P. edulis seedlings were also determined after inoculation with bacterial solution. The effects of endophytic grown-promoting bacteria on the growth of P. edulis seedlings were analyzed. The results show that in the inoculated single bacterial solution， the plant height of the seedlings was significantly increased by 34.2% compared with the control group. While Bacillus amyloliquefaciens JL-B06 significantly increased the root fresh weight of seedlings by 66.67 %， and the best strain for promoting the activity of hydrocatalase was Enterobacter aerogenes CT-B09-2. In the composite bacterial solution treatment， the ratio of 1：2：1 had the best effect on plant height， which increased by 36.10%. The ratio of 2：1：1 was the best for promoting growth of root length and fresh weight， which increased by 44.78% and 70.59%， respectively. The optimal ratio of promoting activity of catalase in leaf cells was 1：1：2. All the inoculated bacterial solution could promote the growth and leaf enzyme activity of P. edulis seedlings， and the compound bacterial solution had better growth promotion effect.

Keyword：Endophytic bacteria; growth-promoting; Moso Bamboo; Growth characteristics; Enzyme activity

毛竹（Phyllostachys edulis），也稱楠竹，為禾本科竹亞科剛竹屬植物，單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，具有生長快、成材早、用途廣、經濟收益大等優點。我國毛竹林面積467.8萬公頃，其中，福建、江西、浙江、湖南四省的毛竹林面積約占全國毛竹林面積的78 %[1]。目前毛竹林豐產栽培手段主要以林分結構調整、水肥營養管理和其他管理措施等，結構調整主要是毛竹年齡結構、林分密度等方面進行調整；水肥管理主要集中在噴滴灌，施肥的種類、使用量及時間等方面；其他措施主要以墾復、除草和植物生長劑等方面，調整土壤的pH，緩解礦質元素的流失，促進毛竹的生長[2]。

內生菌是一類廣泛存在于植物內部的微生物群落，包括細菌、古菌、真菌以及一些非細胞結構的微生物等，以內生細菌、內生真菌和內生放線菌為主。內生細菌通常以菌體的形式通過表皮滲透或氣孔進入等途徑進入宿主體內[3]，合成植物生長激素，刺激植物細胞的分裂分化、伸長、發芽等生命活動[4]，有些菌株可以高效分解土壤中植物無法利用的磷[5]、鉀元素以及從空氣中固氮[6]，提高土壤中可利用礦質元素的含量，促進植物的吸收利用[7]。

目前，植物促生微生物菌劑的開發研究正逐步受到重視，鹿鑫等通過對大豆施加復合微生物菌液，有效提高其株高和葉面積，并抑制雜草的生長[8]；陳思沅等選用發酵乳桿菌為菌液成分，在對玉米施加菌液后，其生長量、根系活力、土壤中的礦主元素均有顯著提升[9]；黃秋良等選用4種菌株對一年生芳樟處理，其結果表明，菌劑的施用可以有效提升芳樟精油含量以及促進其生長[10]；劉耀輝等探究促生菌對毛竹幼苗的作用時，發現促生菌能夠通過調整土壤pH，調控養分元素含量，達到促生的目的[11]。袁宗勝從毛竹葉、竹鞭等部位分離得到多種具有分解土壤礦質元素的內生細菌，可顯著提升毛竹的出筍率和總糖含量，開展內生細菌多樣性和功能研究對于毛竹林豐產培育有著積極的推動作用[12-14]。本文以從毛竹中分離、篩選出的高效解磷解鉀固氮內生細菌[15]，測定其對毛竹幼苗生長量和葉片酶活性的影響，分析內生細菌對毛竹幼苗的促生作用，為后續探究內生細菌對毛竹的促生機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試毛竹幼苗

試驗所用毛竹種子購自廣西桂林。取毛竹種子，經溫水浸泡24 h后播種于裝有無菌土的盆缽中（每盆裝填栽培土約450 g），置于溫室大棚中常規管理，待毛竹幼苗發芽并長到 4葉1芽時，挑選健康、生長基本一致的毛竹幼苗備用。

1.1.2 供試菌株

試驗所用菌株選取從毛竹根、鞭組織中分離并篩選出的具有高效解磷解鉀固氮活性的3株內生細菌，分別是產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）CT-B09-2、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JL-B06、乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1[13，15]，供試菌株保存于福建農林大學菌物研究中心。

1.1.3 菌液制備

將內生促生細菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1分別接種于NB培養基中，28 ℃，125 r·min-1 條件下振蕩培養 72 h，用無菌水稀釋制成含1× 108 cfu/mL 的菌懸液后備用。

1.2 試驗方法

按照表1配制好的內生促生細菌菌液，采用灌根的方式施用于毛竹盆栽幼苗，每組處理重復3次，每個處理施加菌液總量為10 mL，共11組處理（其中第11組為對照處理，采用清水代替菌劑施用于毛竹幼苗），試驗期間， 每周澆水 3 ～ 4 次（保持土壤濕潤）， 常規管理。

1.3 毛竹幼苗生長指標與酶活性測定

1.3.1 毛竹葉片酶活性測定

施用30 d后，采集毛竹幼苗葉片，參照索萊寶公司相關酶活測定試劑盒的使用方法，對毛竹葉片CAT、POD、SOD酶活性及MDA含量進行測定。

1.3.2 毛竹株高、根長和根鮮質量測定

將毛竹幼苗從盆缽中取出，取苗過程中避免根系的物理損傷，洗凈根系表面的浮土，陰干或用干凈的吸水紙吸干多余水分，用剪刀分離地上與地下部分，使用直尺測量其株高和根長；用分析天平上測量毛竹根鮮質量。

1.4 數據處理

用Excel軟件進行數據整理，用SPSS23.0軟件進行顯著性差異（ P ＜ 0.05 ）分析，用origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 內生促生細菌對毛竹幼苗生長量的影響

由表2可以看出，在經過內生促生細菌菌液處理后的毛竹實生幼苗，在其株高、根長和根鮮重三個指標上與對照組處理均有較大差異。在株高測定中，單菌菌液處理中，CT-B09-2菌液對幼苗的株高影響最好，和對照組相比其生長量提高了34.2 %；在復合菌液處理中，三種菌液配制比例為1：2：1時生長效果最好，毛竹幼苗株高有效提升36.10 %，且生長效果復合菌液要優于單菌株菌液。在根長生長量的測定中，單菌菌液處理之間差異不明顯，但幼苗根系生長量均高于對照組，3種菌液均表現出了較好的促生效果；在復合菌液處理方面，內生促生細菌菌液比例為2：1：1的處理對毛竹幼苗根系生長的效果最好，其生長量可提高了44.78 %。在根鮮質量的測定中，單菌菌液處理中，JL-B06菌株對于毛竹幼苗根鮮質量的影響與對照組相比有顯著差異，其相對根鮮重提高66.67 %；復合菌液處理下，菌液配制比例為2：1：1的處理對幼苗根鮮重促進作用最大，其相對質量提高70.59 %，優于單菌菌液處理。測定結果表明：內生促生細菌對于毛竹株高、根長以及根鮮質量均表現出了有一定的促進作用。

2.2.1 POD活性

POD的活性高低可以有效反應植株體的代謝活性[16]。由圖2a可以看出，單菌菌液處理中，接種CT-B09-2菌株的毛竹幼苗與清水對照處理（處理11）相比，毛竹葉片的過氧化物酶（POD）活性差異顯著，且與其它兩種單菌菌液處理之間也存在較大差異；在復合菌液處理中，配制比例為1：1：2的處理可顯著提高毛竹葉片POD活性，且顯著優于單菌菌液處理效果。

2.2.2 SOD活性

從圖2b可以看出，在單菌菌液的處理中，接種WYS-A01-1菌株的毛竹幼苗與清水對照處理相比，毛竹葉片的超氧化物歧化酶（SOD）活性差異顯著，且與其它兩種單菌菌液處理之間也存在顯著差異；在復合菌液處理中，配制比例為2：1：2的處理可顯著提高毛竹葉片SOD活性，且活性要顯著優于單菌菌液處理效果。

2.2.3 CAT活性

從圖2c可以看出，單菌菌液處理中，接種CT-B09-2菌株的毛竹幼苗與清水組處理相比，毛竹葉片的過氧化氫酶（CAT）活性差異顯著，且與其它兩種單菌菌液處理之間也存在顯著差異；在復合菌液處理中，配制比例為1：2：2的處理可顯著提高毛竹葉片的CAT活性。

2.2.4 MDA含量

陳少裕[17]針對植物細胞膜膜脂過氧化研究中指出植株體內MDA含量可以很好的反應出植株體內細胞膜受損程度。從圖2d可以看出，相比于對照組，不論是單一菌液處理或復合菌液處理，MDA含量均有不同程度的下降，其中在單菌菌液處理中，處理1、3的MDA含量為對照組45.00 %和55.00 %；在復合菌液處理中，菌液配制比例為1：1：2處理7的MDA含量最低。

3 結論與討論

株高、根長以及根鮮重等是最直接有效反映處理組之間植物生長差異性的數據指標，而測定葉片的過氧化氫酶類活性和MDA含量，可以直觀的體現該處理下的植物代謝能力的變化量和植物膜脂過氧化程度，從而反應出植物的受損情況。

基于解磷解鉀固氮內生細菌對植物所具有的促生作用，對于不同方面的促生效果的最佳配制比例，本次試驗有不同的結果，對于毛竹株高、根長和重量的提升，生長效果最佳比例菌液配制為處理5；而對于促進葉片細胞代謝活性最佳比例為處理7。本次測定結果可以得出，內生促生細菌產氣腸桿菌、解淀粉芽孢桿菌和乙酸鈣不動桿菌，可以很好的促進毛竹幼苗的地上部分和地下部分的生長，并對于幼苗葉片過氧化氫酶活性的提高有著顯著作用，從而增強毛竹細胞的代謝活性，這與袁宗勝研究一致[15]。

通過對毛竹進行單菌菌液和配制菌液接種處理后，幼苗植株體內維持細胞代謝穩定的相關酶類活性得到強化，可以有效增強幼苗對逆境的抵抗。經過菌液灌根處理后，各處理組的丙二醛（MDA）含量與對照組相比均有不同程度的降低，這與呂亮雨[16]等對于大豆接種菌液處理后得到的結果不一致，其可能的原因在于本試驗所使用的菌種分離自成年毛竹，屬于同種類植物，菌株與試驗植株相適應程度高，是故可以有效降低MDA含量，同時，接種菌液對于SOD、POD等保護酶活性的增強與袁宗勝[18]等對于芳樟接種微生物菌液的結果一致。目前已報道的竹類內生細菌包括根瘤菌屬（Rhizobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、節細菌屬（Arthrobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）等[19]，但對于內生細菌對于竹類促生作用相關報道較少，本試驗探究內生細菌對毛竹的促生影響，初步探討內生細菌對毛竹的促生作用，結果表明產氣腸桿菌、解淀粉芽孢桿菌和乙酸鈣不動桿菌對毛竹幼苗生長的促進作用，可作為促生細菌資源為后續生物菌肥的開發奠定基礎。此外，研究結果表明，在對試驗植株接種促生菌液后，植物的生長性能[20]、根系的吸收能力[21]以及產量[22]均有顯著提高，這與本試驗的結果相一致。

內生菌的侵染定殖過程，目前通常認為包含三個過程，即吸附、侵入和定殖。首先植物組織對內生細菌存在選擇性吸附的機制，而植物與細菌之間親和力的高低，會影響內生細菌侵染植物的效率，內生細菌可選擇的侵染路徑很多，一般的侵染手段包含但不限于通過酶或物理手段打破細胞壁的阻礙，通過植物的自然孔洞。進入植物內部后，內生細菌會尋找適宜的生殖環境而完成定殖。孫真[23]等在對根際細菌的促生作用總結歸納中，認為內生細菌在植株內定殖后，會產生具有刺激性的激素（IAA、GA、CTK等）或ACC脫氨酶等代謝物質，促進植物生長，降低細胞有害物資的含量，維持植株代謝穩定。

目前，對于內生促生細菌的研究越發受到人們的關注，通過對植物生長的根系微環境或植株體內進行菌株的分離，得到可以與其它種類植物形成共生關系的目標菌種，具有良好的研究潛力和開發價值。相關研究表明，在植物生物防治、根系解磷、解鉀固氮、重金屬污染控制等方面，人們均有發現不同種類的微生物菌株可以有效增強植物抗性和緩解環境污染等問題。由此，針對植物內生菌群資源的開發和研究具有重要意義。

本研究以灌根的方式探究單菌菌液和復合菌液處理對幼苗的促生作用，所設置配制菌液比例梯度還需有所精進，部分處理組與對照組之間差異性較小，可能是毛竹幼苗栽培過程中生長條件不完全一致等原因造成。后續將以內生細菌在毛竹植物內定殖過程動態監測以及內生細菌促生機理為探究方向進一步深入研究。同時，還應該針對毛竹不同豐產栽培為目標，研發高效促生復合菌劑，以進一步促進毛竹產業的健康發展。

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