CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾解毒酶和保護酶活性的影響

摘要：為了更好地了解氣候變化下櫟黃枯葉蛾（Trabala vishnou gigantina Yang）的為害趨勢，測定和分析了正常CO2濃度（375 μL/L）和高CO2濃度（750 μL/L）下櫟黃枯葉蛾體內2種解毒酶［谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、乙酰膽堿酯酶（AchE）］和3種保護酶［過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）］的活性。結果表明，櫟黃枯葉蛾不同齡期幼蟲體內2種解毒酶的活性在高CO2濃度下呈上升趨勢，其中GST活性在高CO2濃度下均高于正常CO2濃度，1齡、5齡和6齡幼蟲體內的GST活性與正常CO2濃度之間差異顯著；在高CO2濃度下，3齡至6齡幼蟲的AchE活性均有所升高，其中，5齡、6齡幼蟲體內AchE活性顯著高于正常CO2濃度下相應齡期的活性。在高CO2濃度下，櫟黃枯葉蛾不同齡期幼蟲體內3種保護酶隨齡期的變化不一致，其中CAT活性均呈上升趨勢，且顯著高于正常CO2濃度下相應齡期的活性；POD活性隨著齡期的增加呈先上升后下降的趨勢，1齡、2齡、6齡幼蟲體內POD活性變化不顯著；SOD活性隨齡期的增加整體呈下降趨勢，4齡、5齡、6齡櫟黃枯葉蛾幼蟲體內SOD活性均顯著低于正常CO2濃度下相應齡期的活性。

關鍵詞：櫟黃枯葉蛾（Trabala vishnou gigantina Yang）； CO2濃度； 保護酶； 解毒酶； 活性

中圖分類號：Q968" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）06-0082-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.015

Effects of elevated CO2 concentration on detoxification enzyme and protective enzyme activities of Trabala vishnou gigantina Yang

LOU Ding， LI Xiang， XUE Xi-qin， WANG Pan， LIU Yong-hua

（Yulin University/Shaanxi Key Laboratory of Ecological Restoration in Shanbei Mining Area， Yulin" 719000， Shaanxi， China）

Abstract： To better understand the impact of climate change on Trabala vishnou gigantina Yang， the activities of two detoxification enzymes ［glutathione S-transferase （GST）， acetylcholinesterase （AchE）］ and three protective enzymes ［catalase （CAT）， peroxidase （POD） and superoxide dismutase （SOD）］ were determined and analyzed under normal CO2 concentration （375 μL/L） and high CO2 concentration （750 μL/L）. The results showed that the activities of the two detoxification enzymes in the larvae of different instars of Trabala vishnou gigantina Yang showed an increasing trend under high CO2 concentration， the activity of GST was higher than that under normal CO2 concentration， and the activities of GST in the larvae of the first， fifth and sixth instars were significantly different from those under the normal CO2 concentration； under high CO2 concentration， AchE activity of the 3rd to 6th instars was increased， and AchE activity of the 5th and 6th instars was significantly higher than that of the corresponding instars under normal CO2 concentration. Under high CO2 concentration， the changes of the three protective enzymes in the larvae of different instars of Trabala vishnou gigantina Yang were inconsistent with each other， and the activity of CAT showed an increasing trend， which was significantly higher than that of the corresponding instars under normal CO2 concentration； the POD activity increased first and then decreased with the increase of instar， and there was no significant change of POD activity in the first instar， second instar and sixth instar larvae； the SOD activity of the larvae decreased with the increase of instars， which was significantly lower in the 4th， 5th and 6th instars than that of the corresponding instars under normal CO2 concentration.

Key words： Trabala vishnou gigantina Yang； CO2 concentration； protective enzyme； detoxification enzyme； activity

櫟黃枯葉蛾（Trabala vishnou gigantina Yang）屬鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasioeampidae），已經發現在河南、陜西、寧夏、四川、青海、浙江等省（自治區）均有分布，為害核桃、櫟類、沙棘、板栗、蘋果等。幼蟲啃食葉片，嚴重時將葉片全部吃光，導致沙棘生長受阻、樹勢下降，甚至死亡［1］。櫟黃枯葉蛾在陜西省吳起縣等地的沙棘人工林大面積發生，部分地區沙棘受害率達100%，平均密度為30～58頭/株［2］，嚴重阻礙了當地沙棘林生態經濟效益的發揮［3］。

目前人類面臨氣候不斷變化的全球性問題，而致使氣候變化的一個主要因素是大氣CO2濃度的不斷升高［4］。據聯合國政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental panel on climate change，IPCC）報道，大氣中CO2的濃度在工業革命之前僅為280 μL/L，自1995年以來大氣CO2濃度大約以每年1.9 μL/L的速度遞增［5］，預計到2100年其濃度將達540～970 mg/L［6］。大氣CO2濃度的升高會破壞農林生態系統的平衡，且對植物的健康生長、昆蟲的行為和生理生化等方面產生影響［7，8］。苑冉等［9］研究表明高濃度CO2造成舞毒蛾的幼蟲總發育期以及卵孵化期延長，產卵量和孵化率上升，體內營養物質含量下降，但增加了食物利用率和食物轉化率，蟲體生長受阻。表明舞毒蛾在面對高CO2濃度脅迫時，必須要增加食物用量才能維持其生長，會導致作物為害加劇。劉建業等［10］就西花薊馬和花薊馬成蟲體內解毒酶和保護酶活性在大氣CO2濃度提高情況下的變化進行了大量研究，表明入侵昆蟲西花薊馬和當地近緣種花薊馬2種成蟲體內微粒體多功能氧化酶（MFO）、羧酸酯酶（CarE）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的升高均是由于CO2濃度提高所致；但是在CO2濃度間乙酰膽堿酯酶（AchE）與過氧化物酶（POD）活性的差異并不顯著；王學霞等［11］研究發現煙粉虱體內谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和AchE的活性在CO2濃度升高的情況下分別比正常CO2濃度增加了45.73%和27.68%，但是羧酸酯酶的活性基本沒有變化。李潤紅等［12］研究表明高CO2濃度下，蠶豆葉片化學物質會發生變化，以蠶豆葉片為食的豌豆蚜體內脂肪含量逐漸下降，使得豌豆蚜長距離遷飛能力降低，豌豆蚜的酶活性也因為CO2濃度的升高而受到制約。

AchE和GST在昆蟲體內是重要的解毒酶。解毒酶在昆蟲適應逆境脅迫和植物防御化學物質中起著重要作用，其中，GST能催化生物體內的谷胱甘肽與極性化合物的結合［13-15］，具有清除脂類自由基的作用，被稱作是具有多種解毒功能的同化酶。昆蟲體內同時含有多種重要的防御氧化損傷的保護酶，其中，SOD促進O2的產生，清除體內多余的超氧陰離子自由基并最終生成H2O2；過氧化氫酶（CAT）和POD可以將H2O2分解為H2O。所以在3種保護酶互相配合的作用下，昆蟲體內自由基的數量維持在較低的水平，這樣生物體就能提高自身對逆境脅迫的耐受能力，進而防止其毒害生物體［16，17］。

迄今為止，有關CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾解毒酶和保護酶活性的影響鮮見報道。鑒于此，本研究測定了櫟黃枯葉蛾幼蟲在不同CO2濃度下體內解毒酶和保護酶的活性變化，旨在探究未來氣候變化下櫟黃枯葉蛾的防御和保護機制，為制定新的防治手段提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 櫟黃枯葉蛾卵于2021年4月采自陜西省吳起縣，將卵置于透氣性良好的透明養蟲瓶中，每瓶放蟲卵50粒，然后將養蟲瓶置于培養箱中，溫度設置為（25±1）℃，相對濕度為60%～70%。

1.1.2 供試沙棘 摘取新鮮沙棘枝條，用去離子水洗凈，采用水培法放置在養蟲籠內備用。

1.2 方法

1.2.1 幼蟲飼養 在養蟲瓶內收集100頭12 h內初孵櫟黃枯葉蛾幼蟲，分別置于高CO2濃度（750 μL/L）及正常CO2濃度（375 μL/L）的2個室內CO2人工光照培養箱中（型號RXZ-600C），設置溫度為（25±1） ℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗，每天定時用新鮮的沙棘枝條進行喂養。待櫟黃枯葉蛾蛻皮至6齡幼蟲時停止喂養。

1.2.2 試蟲處理 分別選取大小基本一致的1齡、2齡、3齡、4齡、5齡、6齡幼蟲各10頭，置于CO2濃度培養箱中，然后迅速用液氮冷凍，并轉移到-80 ℃的冰箱中保存備用。

1.2.3 酶液的制備 在80 ℃冰箱中分別取5頭不同齡期的櫟黃枯葉蛾幼蟲，1齡、2齡幼蟲由于體積太小，將幼蟲直接放入研缽中研磨而不必解剖；3齡、4齡、5齡、6齡幼蟲解凍后，迅速置于0～4 ℃預冷的蠟盤上進行解剖，取出中腸和內含物并且稱取其質量，然后放在玻璃勻漿器中，按1∶9（質量∶體積，g∶mL）的比例，加入相應體積的NaCl，機械勻漿（冰水浴），將所得的勻漿液置于離心機中冷凍離心15 min（轉速為2 500 r/min），上清液就是待測酶液，將待測酶液置于4 ℃冰箱中，以備24 h內使用。

1.2.4 解毒酶活性測定方法

1）谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）活性測定。測定方法根據上海索寶生物科技有限公司生產的試劑盒說明書進行操作，在340 nm處測定吸光度，計算櫟黃枯葉蛾幼蟲體內GST活性。

2）乙酰膽堿酯酶（AchE）活性測定。測定方法根據上海索寶生物科技有限公司生產的試劑盒說明書進行操作，在412 nm處測定吸光度，計算櫟黃枯葉蛾幼蟲體內AchE活性。

1.2.5 櫟黃枯葉蛾保護酶活性的測定方法

1）過氧化氫酶（CAT）活性測定。測定方法根據上海索寶生物科技有限公司生產的試劑盒說明書進行操作，在240 nm處測定吸光度，計算櫟黃枯葉蛾幼蟲體內CAT活性。

2）過氧化物酶（POD）活性測定。測定方法根據上海索寶生物科技有限公司生產的試劑盒說明書進行操作，在420 nm處測定吸光度，計算櫟黃枯葉蛾在不同CO2濃度培養下幼蟲體內POD的活性。

3）超氧化物岐化酶（SOD）活性測定。測定方法根據上海索寶生物科技有限公司生產的試劑盒說明書進行操作，在560 nm處測定吸光度，計算櫟黃枯葉蛾幼蟲體內SOD的活性。

1.2.6 數據處理與統計分析 通過Excel 2010軟件和DPS 23.0軟件對試驗數據進行分析，對不同齡期櫟黃枯葉蛾在不同CO2濃度條件下的解毒酶、保護酶活性等數據進行方差分析（ANOVA），并利用Duncan氏新復極差法比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾幼蟲解毒酶活性的影響

CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾幼蟲不同齡期體內GST活性的影響如圖1所示，無論是在高CO2濃度還是正常CO2濃度下，櫟黃枯葉蛾6個齡期體內GST活性均隨著齡期的增長而呈先下降后上升的趨勢，其中在高CO2濃度下，不同齡期櫟黃枯葉蛾幼蟲體內的GST活性較正常CO2濃度的活性整體呈上升趨勢。1齡、5齡和6齡櫟黃枯葉蛾幼蟲體內的GST活性與正常CO2濃度相應齡期之間差異顯著，而2齡、3齡、4齡之間差異不顯著。

如表1所示，在高CO2濃度下櫟黃枯葉蛾5齡、6齡幼蟲體內AchE活性與正常CO2濃度下相應齡期之間差異顯著，高CO2濃度下1齡至4齡幼蟲的AchE活性分別為0.290、0.253、0.284、0.280 U/mg ，與低CO2濃度下相應齡期之間差異不顯著。櫟黃枯葉蛾3齡、4齡幼蟲體內AchE活性在高CO2濃度下有所升高，5齡、6齡幼蟲體內AchE活性在高CO2濃度下顯著高于正常CO2濃度下對應齡期的活性。

2.2 CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾幼蟲體內保護酶活性的影響

CO2濃度升高對櫟黃枯葉蛾不同齡期幼蟲體內CAT活性的影響如圖2所示，在高CO2濃度下，櫟黃枯葉蛾幼蟲體內CAT活性均隨著齡期的增加而升高，且每一齡期幼蟲體內的CAT活性均顯著高于正常CO2濃度下相應齡期的活性。在正常CO2濃度下，櫟黃枯葉蛾4齡幼蟲體內的CAT活性在整體發育階段上升趨勢中有所減弱。

如表2所示，櫟黃枯葉蛾不同齡期幼蟲體內POD活性呈先上升后下降的趨勢。在高CO2濃度下，不同齡期幼蟲體內POD活性為8.400～11.533 U/mg，在幼蟲4齡期POD活性較正常CO2濃度下影響最大。其中，1齡、2齡和6齡櫟黃枯葉蛾幼蟲體內的POD活性在2種CO2濃度下變化差異不顯著，而高CO2濃度下3齡、4齡、5齡櫟黃枯葉蛾幼蟲體內的POD活性與正常CO2濃度下相應齡期之間差異顯著。

不同齡期櫟黃枯葉蛾幼蟲體內SOD活性隨著CO2濃度的升高呈明顯的下降趨勢（圖3）。高CO2濃度下1齡至2齡幼蟲體內SOD活性略高于正常CO2濃度下的活性，但二者之間差異不顯著，而高CO2濃度下4齡、5齡、6齡櫟黃枯葉蛾幼蟲體內SOD活性均顯著低于正常CO2濃度下的活性，3齡幼蟲體內SOD活性顯著高于正常CO2濃度下的活性。在櫟黃枯葉蛾幼蟲發育1齡、2齡階段SOD活性無顯著變化，正常CO2濃度下在櫟黃枯葉蛾幼蟲3齡階段的SOD活性達到最低，且高CO2濃度下自櫟黃枯葉蛾幼蟲3齡起開始呈明顯下降趨勢。

3 討論與小結

AchE作為昆蟲體內解毒酶在生物神經傳導中的一種關鍵性酶，具有神經發育作用與再生能力，在保持神經突觸傳導的同時，可以迅速水解易興奮的神經遞質乙酰膽堿，在昆蟲適應逆境脅迫中起重要作用，而酶活力增強一般是昆蟲對有毒物質脅迫做出的一種應激反應［18-20］。本研究結果表明，櫟黃枯葉蛾不同齡期幼蟲體內AchE的活性隨著CO2濃度的升高呈上升趨勢，5齡、6齡幼蟲達到顯著差異。本試驗結果與曾蕓蕓等［21］在高CO2濃度下水稻褐飛虱體內AchE活性研究結論不一致，水稻褐飛虱體內AchE的活性隨著CO2濃度的提高而顯示出下降的趨勢，這可能與2種昆蟲的生理習性、對外的抵抗機制有關。徐艷聆等［22］進行了亞洲玉米螟幼蟲體內谷胱甘肽轉移酶活性變化的研究，表明隨著殺蟲蛋白質攝入時間的延長，酶活性明顯下降，這與本試驗研究的結果相反。本研究結果顯示，櫟黃枯葉蛾幼蟲GST活性在1齡至4齡隨著CO2濃度的增加而下降，在5齡、6齡GST活性則逐漸上升。這可能是由于隨著櫟黃枯葉蛾齡期的增加，其對高CO2濃度的環境越來越適應。

將昆蟲體內氧自由基控制在低水平，從而防止毒害生物體，這離不開其體內三大保護酶的分工與協調。SOD可以清除超氧陰離子自由基，將其快速歧化成H2O2和O2，H2O2則由CAT、POD分解成H2O和O2，使3種保護酶相互配合，形成一種較為穩定的模式，增強了生物體的抗逆能力［23，24］。本研究結果表明，隨著CO2濃度的升高，櫟黃枯葉蛾幼蟲體內CAT活性明顯上升，POD活性隨著CO2濃度的增高呈先上升后下降的趨勢，而此時SOD活性顯著下降，且隨著齡期的增長，尤其是4～6齡幼蟲的差異更明顯，此時體內自由基積累越來越多，無法清除出去。因此，CO2濃度的上升使櫟黃枯葉蛾幼蟲體內CAT、POD和SOD 3種保護酶的動態平衡處于一種紊亂狀態，蟲體易受到外界的傷害。這與陳曉燕等［25］研究黏蟲在高CO2濃度下其酶活性變化的規律一致，CAT、POD活性上升，SOD活性下降也是黏蟲對高CO2濃度的反應機制。

綜上所述，在高CO2濃度的條件下，櫟黃枯葉蛾體內的大多數酶系活性呈上升趨勢，大部分解毒酶活性受到抑制，SOD、POD和CAT 3種保護酶的動態平衡發生紊亂，機體受損從而影響櫟黃枯葉蛾正常的生理代謝。CO2濃度增加已經是未來氣候變化中最明顯的特征，而昆蟲為了在當下的環境更好地生存以及繁衍其后代，勢必會從生理行為各方面做出響應。因此，掌握櫟黃枯葉蛾在高CO2濃度下的酶活性變化機制，可以在未來氣候變化環境下制定適宜的防治策略，從而為沙棘人工林營造以及沙棘產業的良性發展提供理論基礎支持。

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收稿日期：2022-06-28

基金項目：國家自然科學基金項目（31760209）；陜西省教育廳重點科研計劃項目（21JS045）

作者簡介：婁 丁（1997-），女，四川樂山人，在讀碩士研究生，研究方向為農作物有害生物控制研究，（電話）17760133394（電子信箱）lding0407@126.com；通信作者，劉永華（1978-），男，山西陽泉人，副教授，博士，主要從事農作物有害生物控制研究，（電話）13571216403（電子信箱）liuyonghuaa@126.com。