植物炭黑對九種水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果

摘要：為研究植物炭黑對常見水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果，采用瓊脂稀釋法測定植物炭黑對9種水產(chǎn)致病菌的最小抑菌濃度，并將受試菌懸液和不同濃度的植物炭黑混合，測定受試菌的吸附率、解吸附率和植物炭黑吸附力。結(jié)果表明，植物炭黑對溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的MIC均為200 mg/mL，對遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）MIC為12.5 mg/mL，對其他6種致病菌的MIC均為25 mg/mL；當(dāng)受試菌濃度為106 CFU/mL時，隨著植物炭黑濃度的增加，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，解吸附率逐漸減小，至0后保持不變，且當(dāng)植物炭黑濃度為2 mg/mL時，試驗組受試菌的吸附率均可達(dá)100%，解吸附率均為0；當(dāng)受試菌濃度保持不變，植物炭黑濃度逐漸增加時，植物炭黑吸附力逐漸減小。因此，植物炭黑對常見水產(chǎn)致病菌具有較好的吸附效果，對淡水致病菌的抑制性強于海水致病菌。

關(guān)鍵詞：植物炭黑；水產(chǎn)致病菌；抑制；吸附

中圖分類號：S965.117" " " " "文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）06-0125-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.023 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Inhibition and adsorption effect of plant carbon black on 9 aquatic pathogenic bacteria

CHEN Bin1，LIN Yu1，F(xiàn)AN Hai-ping1，XUE Ling-zhan1，YUAN Li-hua2，ZHONG Quan-fu1

（1.Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province，F(xiàn)uzhou" 350002，China；

2.Fujian Fishery Technical Extension Center，F(xiàn)uzhou" 350003，China）

Abstract：In order to verify the inhibition and adsorption effect of plant carbon black on common aquatic pathogens， the agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration of plant carbon black on 9 aquatic pathogens， and the test bacteria suspension was mixed with different amounts of plant carbon black to determine the adsorption rate， desorption rate and adsorption capacity. The results showed that the MIC value of plant carbon black to Vibrio alginolyticus and Vibrio harveyi were both 200 mg/mL， the MIC value to Edwardsiella tarda was 12.5 mg/mL， and the MIC value of the other 6 pathogenic bacteria were all 25 mg/mL. When the concentration of the tested bacteria was 106 CFU/mL， with the increasing of the amount of plant carbon black， the adsorption rate of the tested bacteria gradually increased， and finally it remained unchanged to 100%. And the desorption rate gradually decreased， and finally remained unchanged to 0. When the concentration of plant carbon black was 2 mg/mL， the adsorption rate of every test group could reach 100%， and the desorption rate was 0. At the same time， The adsorption capacity of carbon black on the tested bacteria gradually decreased. Therefore， it could be determined that plant carbon black had a good adsorption effect on common aquatic pathogens， and its inhibitory effect on freshwater pathogens was stronger than that of seawater pathogens.

Key words： plant carbon black； aquatic pathogens； inhibition； adsorption

植物炭黑的主要成分為活性炭，其以天然植物秸稈為原料，經(jīng)過高溫碳化、活化后制得，已初步在中國食品工業(yè)和動物飼料方面得到應(yīng)用。2015年5月24日實施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 植物炭黑》要求的植物炭黑可以作為食品添加劑、著色劑應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。研究表明，植物炭黑具有吸附玉米赤霉烯酮的能力，大鼠飼糧中添加植物炭黑可以緩解玉米赤霉烯酮導(dǎo)致的大鼠生長性能下降和繁殖系統(tǒng)紊亂［1］，仔豬飼糧中添加0.1%植物炭黑能緩解嘔吐毒素引起的斷奶仔豬生長性能和血清抗氧化能力的下降，抑制嘔吐毒素造成的空腸蔗糖酶活性的異常升高［2］，大刺鰍飼料中添加植物炭黑，顯著提高大刺鰍的酶活力和生長速度［3］。目前，植物炭黑對水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果的研究尚無報道。

水產(chǎn)病原菌抗藥性增加和水產(chǎn)品藥物殘留問題是制約中國水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，越來越受到社會的廣泛關(guān)注。目前已有很多研究者將中草藥制劑、益生菌、免疫增強劑、生物漁藥等作為飼料添加劑替代抗生素應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中［4-6］。而植物炭黑具有綠色無污染、價廉易得、吸附性強、不參與機體代謝等特點［7］，適合應(yīng)用到水產(chǎn)的綠色養(yǎng)殖生產(chǎn)和疾病的防控過程中。因此，本研究以植物炭黑為材料，探索其對常見水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附作用，為其在水產(chǎn)細(xì)菌性疾病的防控應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）、腦膜膿毒性伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）為福建省淡水水產(chǎn)研究所收集菌株，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）來自福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）、弧菌選擇瓊脂（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS）均購自海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 植物炭黑 植物炭黑由福建省順昌縣碳娃娃生物科技有限公司提供，主要成分為植物炭黑，以原木材加工中產(chǎn)生的杉木屑、松木屑和竹屑，以及中草藥植物白頭翁、艾葉、馬齒莧、魚腥草、鳳尾草等為原料，經(jīng)高溫碳化、活化等工藝后制得。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物炭黑對9種水產(chǎn)致病菌的抑菌性 采用瓊脂稀釋法［8］，將植物炭黑加入NA或TCBS培養(yǎng)基中，配制植物炭黑的濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL的培養(yǎng)基，對照組培養(yǎng)基不添加植物炭黑；配制受試菌懸液，濃度調(diào)整為107 CFU/mL；接種受試菌于不同濃度的植物炭黑平板上，接種后所形成的菌液圈直徑5～8 mm，每個試驗組均設(shè)置3個平行；接種后的培養(yǎng)基28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。

結(jié)果判定：菌落生長被完全抑制的最低抗懸液濃度為該樣品對受試菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.2 植物炭黑對9種水產(chǎn)致病菌的吸附性 配制受試菌懸液，濃度調(diào)整為106 CFU/mL；分別稱取0、5、10、20、40 mg植物炭黑加入至50 mL的離心管中，編號為組1、組2、組3、組4、組5，其中組1為對照組，組2至組5為試驗組，然后均加入10 mL受試菌懸液，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，每組植物炭黑濃度設(shè)置3個平行；取出離心管，靜置30 min，取上清液進行平板計數(shù)；吸附試驗結(jié)束后，棄上清液，將剩余固體物加入10 mL生理鹽水，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，靜置30 min，取上清液進行平板計數(shù)。

結(jié)果判定：受試菌吸附率=（P2-P1）/（P2）×100%；受試菌解吸附率=（P3）/（P2-P1）×100%；植物炭黑吸附力（CFU/mg）=（P2-P1）/M［9］。

式中，P1為吸附試驗試驗組上清液中細(xì)菌濃度，P2為吸附試驗對照組上清液中細(xì)菌濃度，P3為解吸附試驗試驗組上清液中細(xì)菌濃度，M為吸附試驗中植物炭黑濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物炭黑的抑菌性

由表1可知，嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、惡臭假單胞菌、無乳鏈球菌、腦膜膿毒性伊麗莎白菌對植物炭黑的MIC均為25 mg/mL，遲緩愛德華菌對植物炭黑的MIC為12.5 mg/mL，溶藻弧菌和哈維氏弧菌對植物炭黑的MIC為200 mg/mL。9種致病菌中溶藻弧菌和哈維氏弧菌主要感染海水魚類，其對植物炭黑的MIC遠(yuǎn)高于其他7種致病菌。

2.2 植物炭黑的吸附性

由表2可知，植物炭黑對9種受試菌均有明顯的吸附效果。隨著植物炭黑濃度的增大，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，解吸附率逐漸減小，至0后保持不變。當(dāng)植物炭黑濃度達(dá)到2 mg/mL時，試驗組受試菌吸附率均可達(dá)100%，受試菌解吸附率均為0。

由表2、表3可知，在9種受試菌中，當(dāng)受試菌吸附率遠(yuǎn)小于100%時，隨著植物炭黑濃度的增加，植物炭黑的吸附力逐漸降低，即單位體積的植物炭黑所吸附的菌體數(shù)量逐漸減少；當(dāng)受試菌吸附率達(dá)到100%后，植物炭黑濃度每增加1倍，吸附力約降低為原來的1/2，因植物炭黑過量，此時計算的吸附力值無效。

3 小結(jié)與討論

本試驗所用植物炭黑的生產(chǎn)原料中包括白頭翁、艾葉、馬齒莧、魚腥草、鳳尾草等多種中草藥植物，中草藥成分均具有較好的抑菌和殺菌效果［10-14］。因此，試驗中植物炭黑表現(xiàn)出的抑菌作用可能與所添加中草藥中抑菌成分有關(guān)。而且，有研究表明生物碳中含有大量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子，它們以氧化物或碳酸鹽的形式存在于灰分中，溶于水后呈堿性［15］，當(dāng)植物炭黑添加到培養(yǎng)基中時，增加了培養(yǎng)基的鹽度和pH，改變了細(xì)菌的最適生長環(huán)境，對細(xì)菌也呈現(xiàn)一定的抑制作用。而溶藻弧菌和哈維氏弧菌均為嗜鹽弧菌，在一定的鹽濃度條件下才能正常生長［16］，因此植物炭黑的添加對其抑制作用較弱，海水病原菌的MIC明顯高于淡水病原菌。

植物炭黑的主要成分是活性炭，微孔結(jié)構(gòu)多，具有較大的比表面積［17］，對有害物質(zhì)、病原菌、重金屬等都具有較強的吸附作用［7，18］。本試驗中植物炭黑對9種水產(chǎn)致病菌的吸附作用明顯，當(dāng)受試菌濃度不變時，隨著植物炭黑濃度的增加，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，受試菌解吸附率卻逐漸降低，至0后保持不變，說明植物炭黑濃度較低時對受試菌吸附不牢固、易釋放，植物炭黑濃度較高時對受試菌吸附牢固、不易釋放，可以利用王麗坤等［19］的研究結(jié)果進行解釋，即當(dāng)被吸附物濃度較高時，分子間的作用和擁擠現(xiàn)象變得明顯，被吸附物的狀態(tài)為垂直取向，當(dāng)被吸附物濃度變低時，被吸附物的狀態(tài)變?yōu)槠椒∠颍椒∠蛭奖却怪比∠蛭浇佑|面大，吸附更牢固。

而當(dāng)被吸附物狀態(tài)為垂直取向時，吸附單位所占的表面積最小，吸附物單位表面有更大的吸附容量、吸附力大，被吸附物狀態(tài)為平伏取向時，吸附單位所占的表面積大，吸附物單位表面吸附容量變小，吸附力變小［19］，與本研究結(jié)果一致，即當(dāng)受試菌濃度保持不變，植物炭黑濃度逐漸增加時，植物炭黑的吸附力逐漸減小。

植物炭黑對7種淡水病原菌的抑制作用明顯強于2種海水病原菌，且植物炭黑對9種水產(chǎn)致病菌均有較強的吸附作用。因此，植物炭黑可以作為水質(zhì)改良劑或飼料添加劑應(yīng)用于淡水魚類的養(yǎng)殖和病害防控中。

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收稿日期：2022-04-08

基金項目：國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-45-41）

作者簡介：陳 斌（1986-），男，河南正陽人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，（電話）15705902453（電子信箱）1549361186@qq.com；通信作者，樊海平（1967-），男，江蘇常州人，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，（電子信箱）fanhaiping16@163.com。