厚樸中總鞣質提純工藝及抗菌活性研究

摘要：通過響應面設計優化厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）中總鞣質的提取工藝，并進一步純化。結果表明，厚樸中總鞣質的最佳提取工藝為料液比1∶13、提取時間100 min、乙醇濃度80%、超聲功率80 W，厚樸總鞣質提取量為0.181 0 mg/g，與理論值0.188 8 mg/g差距小。利用正交試驗考察明膠溶液沉淀法對厚樸總鞣質的最佳純化工藝為濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，厚樸總鞣質提取量為2.743 mg/g。利用最小抑菌濃度測定法比較總鞣質對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性，表明厚樸中總鞣質具有一定的抗菌活性。

關鍵詞：厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）；總鞣質；響應面法；正交試驗；抗菌活性

中圖分類號：R284.2" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）06-0129-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.024

Study on the purification technology and antibacterial activity of total tannins from

Magnolia officinalis

YANG Min1，XI Jun-wei2

（1.Shaanxi Institute of International Tradeamp;Commerce，Xi’an" 712046，China；

2.Shaanxi Adverse Drug Reaction Monitoring Center， Xi’an" "710000，China）

Abstract： The extraction process of total tannins from Magnolia officinalis was optimized by response surface design and further purified. The results showed that the best extraction process for total tannins from Magnolia officinalis was the ratio of material to liquid of 1∶13， extraction time of 100 min， ethanol concentration of 80% and ultrasonic power of 80 W. The total tannins extracted from Magnolia officinalis was 0.181 0 mg/g， which was not far from the theoretical value of 0.188 8 mg/g. The optimum purification process of total tannins from Magnolia officinalis by gelatin solution precipitation was studied by an orthogonal test. When the specific gravity of concentrated solution was 1.5 mg/mL， the concentration of gelatin solution was 4%， and the amount of gelatin solution added was 8 mL/100 mg， the total tannins extracted from Magnolia officinalis was 2.743 mg/g. The antibacterial activities of total tannins against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were compared by the minimum inhibitory concentration method. The results showed that the total tannins from Magnolia officinalis had certain antibacterial activity.

Key words： Magnolia officinalis Rehd. et Wils.； total tannins； response surface methodology； orthogonal test； antibacterial activity

厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）為木蘭科植物［1］，在南方地區分布較多［2］，分為厚樸和凹葉厚樸。厚樸具有很強的抗菌療效，能夠有效地控制牙周病原體、致齲菌和突變菌株的病情發展。此外還具有促消化［3］、抗氧化［4］、消炎止痛等功效，其組分復雜，包含約100種成分，其中含量較高的為黃酮類、多糖及木質素類，總鞣質含量為1%～3%［5］。厚樸酚類物質中以厚樸酚以及和厚樸酚為主，其提取、純化工藝及活性已經得到廣泛研究。在厚樸酚及和厚樸酚提取純化過程中的鞣質類物質均以廢棄物處理，越來越多的研究表明，鞣質類物質具有抗腫瘤［6］、抗氧化［7，8］、抗菌［9］等藥理活性。本試驗采用超聲輔助法提取厚樸總鞣質，蛋白質沉淀法進行回收，并測定其抗菌活性，變廢為寶，以充分利用厚樸資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

厚樸（產自陜西安康）、大腸埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44102）、去離子水、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）、沒食子酸對照品（批號：140306）、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂粉、NaOH、生理鹽水、無水碳酸鈉、無水乙醇、磷鉬鎢酸試劑等，試驗所用試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

FA20048型電子天平，上海精密儀器有限公司；TU-1810型紫外可見光-分光光度計，上海長城制造有限公司；YXQ-LS-50SII型高壓蒸汽滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；GDW-100型恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；XZ-1B型濁度儀，常州德杜精密儀器有限公司；YP202N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；RE-2000E型旋轉蒸發儀，鞏義市瑞力儀器設備有限公司；SHZ-III型循環水真空泵，鄭州賽特利斯生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總鞣質的測定

1）沒食子酸標準曲線繪制。精密稱量5 mg沒食子酸標準品，配制0.5 mg/mL水溶液，取不同體積標準液，通過磷鉬鎢酸比色法，在760 nm的波長下測定其吸光度，建立沒食子酸標準曲線［10］，線性關系在試驗范圍內有效（圖1）。

2）總鞣質含量的計算。計算公式：總鞣質含量=總酚量-不被吸收的多酚量。

其中，總酚含量的測定依據“1.3.1”的方法進行測定，不被吸收的多酚量依據干酪素反應進行測定［11］。

1.3.2 厚樸總鞣質提純方法 稱取定量鮮厚樸原料，用一定濃度的乙醇溶液進行超聲提取，提取液濃縮成不同的比重，趁熱分別加入不同比例的明膠溶液至沉淀完全，放冷濾過，濾渣加入乙醇進行溶解，蒸干溶劑即可得總鞣質提純物。

1.3.3 厚樸總鞣質抗菌活性測定

1）菌種活化及菌懸液制備。將凍干菌種粉末在無菌條件下接種于復壯液中，37 ℃培養18 h，將細菌培養液均勻涂布在平板中繼續培養24 h，再選取對數生長曲線內的細菌菌落接種于液體培養基中培養18～24 h，將菌液用無菌水稀釋，經比濁儀對比，將其濃度調整為1×107 CFU/mL。

2）總鞣質溶液制備及MIC測定。將粗總鞣質（樣品1）及總鞣質精品（樣品2）分別配制成16 mg/mL和6 mg/mL的溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，利用試管稀釋法［12］測定總鞣質對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC，取12支試管，2～11號試管用液體培養基對樣品溶液進行梯度稀釋，總體積為" " 1 mL，再分別加入1 mL制備好的菌懸液，1號試管加入1 mL樣品溶液和1 mL菌懸液作為陽性對照，12號試管加入2 mL液體培養基作為陰性對照，于37 ℃培養24 h，觀察溶液不出現渾濁時所對應的濃度為該細菌的MIC。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對厚樸中總鞣質提取量的影響 在超聲功率140 W、料液比1∶20和乙醇濃度80%的條件下，考察提取時間對厚樸中總鞣質提取量的影響。由圖2可知，提取時間在20～80 min時，厚樸總鞣質提取量呈先減少后增加的趨勢，60～80 min時，總鞣質提取量變化比較大，當提取時間為80 min時，總鞣質提取量達到最大值0.120 mg/g。隨著提取時間繼續增加，總鞣質的提取量逐漸減少。其原因可能是由于超聲波空化時產生的高溫條件，使得大分子物質斷裂而損失。故最佳提取時間為80 min。

2.1.2 料液比對厚樸中總鞣質提取量的影響 在超聲功率140 W、提取時間80 min和乙醇濃度80%的條件下，考察料液比對厚樸中總鞣質提取量的影響。由圖3可知，在1∶10至1∶40的范圍內，隨著提取劑添加量不斷加大，厚樸中總鞣質提取量總體呈先增加再減少的趨勢。在1∶15至1∶40的范圍內，隨著溶劑的不斷增加，厚樸中總鞣質提取量呈迅速下降、緩慢上升又繼續下降的趨勢。分析其原因可能是，當乙醇溶液達到一定量時，厚樸中總鞣質溶解已經達到飽和，再增加乙醇溶液也不會使厚樸中總鞣質含量增加，但此時隨著鞣質溶出的雜質卻增多，從而導致有效成分的相對含量逐漸減少。厚樸中總鞣質提取量在料液比為1∶15 時為最大值。

2.1.3 乙醇濃度對厚樸中總鞣質提取量的影響 在超聲功率140 W、料液比1∶15和提取時間80 min的條件下，考察乙醇濃度對厚樸中總鞣質提取量的影響。由圖4可知，隨著乙醇體積分數持續增加，從厚樸中提取的總鞣質量呈先增加后減少的趨勢。當乙醇濃度為80%時，從厚樸中提取的總鞣質量最大。當乙醇濃度超過80%時，厚樸總鞣質提取量急劇下降。分析原因可能是，乙醇濃度的增大有助于厚樸中總鞣質的浸出，但由于總鞣質中含有大量酚羥基，當乙醇濃度高時，脂溶性組分的沉淀限制了總鞣質的提取。因此，最佳乙醇濃度為80%。

2.1.4 超聲功率對厚樸中總鞣質提取量的影響 在乙醇濃度80%、料液比1∶15和提取時間80 min的條件下，考察超聲功率對厚樸中總鞣質提取量的影響。由圖5可知，隨著超聲功率增大，厚樸中總鞣質的提取量先增大后減小。當超聲功率在40～100 W時，總鞣質提取量由0.052 2 mg/g增加至0.209 7 mg/g。而當達到100 W后，隨著超聲功率的增加提取量減小，此時超聲功率對總鞣質的提取未出現促進作用。這可能是由于對于一定強度和發射表面的超聲波，功率增加時聲音強度增加，聲壓幅度和液體中的壓力也增加，產生的空化氣泡破裂所需的時間將變短，從而有利于提取量的增加，但當溶質擴散濃度達到平衡時，增大超聲功率反而造成提取量的下降。由此可得最佳超聲功率為100 W，可選擇該功率用于隨后的響應面分析試驗。

2.2 Box-Behnken試驗的結果分析

在單因素試驗基礎上，選擇提取時間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、超聲功率（D），利用Design-Expert 8. 0. 6軟件進行響應面試驗設計，結果如表1、表2所示。

對試驗結果進行系統統計和分析，求得總鞣質提取量（Y）對提取時間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）和超聲功率（D）的回歸模型為：Y=0.16+0.005 24A-0.009 367B-0.008 417C-0.008 575D-0.002 425AB+0.020AC - 0.013AD + 0.003 650BC + 0.004 975BD -0.003 725CD-0.011A2-0.021B2-0.019C2-0.001 745D2。

由表3可知，回歸模型（Plt;0.05）顯著，失擬項不顯著（P=0.117 0gt;0.05），可信度較高。方程的決定系數R2=0.966 9，Radj2=0.933 8，說明實際數據非常接近理論值，可解釋度高。4個因素中，提取時間對厚樸總鞣質的提取量影響不顯著，提取時間與乙醇濃度、超聲功率之間的交互作用明顯，四因素對響應值的影響大小為料液比gt;超聲功率gt;乙醇濃度gt;提取時間。

圖6為各因素交互作用對總鞣質提取量的影響，由3D圖陡峭程度可知，因素AC、AD交互作用明顯。料液比最佳取值范圍為1∶12至1∶15，提取時間在90～100 min有最大值，乙醇濃度在75%～85%對響應值的影響顯著，提取功率的最佳取值范圍為80～96 W，得到的最佳提取工藝為料液比1∶13.12、提取時間100 min、乙醇濃度83.57%、超聲功率80 W，厚樸總鞣質提取量為0.188 8 mg/g。根據實際情況可將工藝調整為料液比1∶13、提取時間100 min、乙醇濃度80%、超聲功率80 W，將原料量擴大10倍，按照優化的工藝進行3次驗證試驗，厚樸中總鞣質提取量分別為0.181 3、0.179 2、0.182 6 mg/g，平均值為0.181 0 mg/g，與理論值相差小，故工藝可行。

2.3 厚樸總鞣質純化結果

稱取500 g厚樸鮮原料，經粉碎，以最優工藝提取3次，提取液合并濃縮，使其比重為2.5 mg/mL，稀釋為2.0、1.5、1.0、0.5 mg/mL濃度的溶液，配制1%、2%、3%、4%、5%明膠溶液，以2、4、6、8、10、12 mL/100 mg作為添加量，經單因素試驗確定最佳取值范圍，利用正交試驗設計確定最優組合，結果見表4、表5。

分析正交試驗結果，均值響應表顯示響應值影響大小為明膠溶液添加量gt;明膠溶液濃度gt;濃縮液比重，其最佳組合為X12X22X33，即濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，從方差分析結果（表6）可知，明膠溶液添加量對響應值影響最顯著。

2.4 厚樸總鞣質抗菌活性測定結果

通過梯度稀釋法測定粗總鞣質（樣品1）及總鞣質精品（樣品2）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC。表7結果顯示，樣品1對大腸埃希菌的MIC為0.25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL；樣品2對大腸埃希菌的MIC為4.69×10-2 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為2.34×10-2 mg/mL。通過抗菌活性的測定可以看出，厚樸總鞣質的純度越高抗菌活性越強，同一濃度下，其對金黃色葡萄球菌的抗菌活性大于對大腸埃希菌的抗菌活性。

3 結論

試驗通過響應面設計優化厚樸中總鞣質的提取工藝，并進一步純化，其中，提取工藝為料液比1∶13、提取時間100 min、乙醇濃度80 %、提取功率80 W；純化工藝為濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，工藝可靠，在純化過程中對其他成分的破壞性小；利用最小抑菌濃度測定法比較總鞣質對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性，結果表明，厚樸中的總鞣質具有一定的抗菌活性，且對革蘭氏陽性菌的抗菌活性大于革蘭氏陰性菌，研究結果可對厚樸藥材資源的充分利用與開發提供理論基礎。

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收稿日期：2023-03-13

基金項目：國家科技部重大新藥創制項目（2018ZX09721-005-009-013）；陜西國際商貿學院中藥質量標志物創新團隊項目（SSY18TD02）

作者簡介：楊 敏（1986-），女，陜西咸陽人，實驗師，主要從事中藥制藥及成分分析研究，（電話）18091041916（電子信箱）375477274@qq.com；通信作者，奚軍偉（1979-），男，陜西大荔人，副主任藥師，主要從事中藥制藥及藥品不良反應研究，（電話）13575571093（電子信箱）315948175@qq.com。