水稻抗褐飛虱基因Bph43緊密連鎖KASP標記開發與驗證

摘要：為促進Bph43基因在抗褐飛虱（Nilaparvata lugens）水稻品種選育中的應用，在前期Bph43精細定位的基礎上，將Bph43基因供體親本IRGC 8678進行重測序，通過與日本晴參考基因組以及3 000份水稻測序公共數據庫資源進行SNP變異位點分析，設計開發出Bph43緊密連鎖區間特異的KASP標記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）。66份水稻自然群體及200份BC1F2代雜交后代的驗證結果表明，開發的3個KASP標記是共顯性標記，標記基因型分析結果與抗褐飛虱表型完全符合，能特異、準確地檢測出水稻中是否含有Bph43基因。基于SNP位點開發的Bph43 KASP標記可用于發掘攜帶Bph43基因的新種質及抗褐飛虱分子標記輔助選擇育種。

關鍵詞：水稻；褐飛虱（Nilaparvata lugens）；Bph43；KASP標記；抗褐飛虱育種

中圖分類號：S435" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）06-0169-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.031

Development and validation of a tightly linked KASP marker for the rice brown planthopper resistance gene Bph43

DENG Zhao1，2， WANG Kai1， DU Bo3， ZHU Li-li3， YANG Yuan-zhu1，2， CHEN Rong-zhi3，4

（1. Key Laboratory of Southern Rice Innovat amp; Improvement Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hunan Engineering Laboratory for Disease and Pest Resistant Rice Breeding， Yuan Longping High-Tech Agriculture Co.， Ltd.，Changsha" 410128， China；2. College of Agriculture， Hunan Agriconomy University， Changsha" 410128， China； 3.School of Life Sciences/State Key Laboratory of Hybrid Rice，Wuhan University， Wuhan" 430072， China； 4.Shenzhen Research Institute， Wuhan University， Shenzhen" 518057，Guangdong， China）

Abstract： To promote the application of Bph43 in the breeding of rice varieties resistant to brown planthopper，on the basis of fine mapping of Bph43 in the early stage， the Bph43 gene donor parent IRGC 8678 was resequenced. By conducting SNP mutation site analysis with the Japanese reference genome and 3 000 rice sequencing public database resources， the study designed and developed Bph43 tightly linked interval specific KASP markers （K_11674982， K_11775428， and K_11856768）. The validation results of 66 natural populations of rice and 200 BC1F2 hybrid progeny showed that the three developed KASP markers were codominance markers， and the genotype analysis results of the markers were completely consistent with the phenotype of brown planthopper resistance， which could specifically and accurately detect whether there was Bph43 gene in rice. The Bph43 KASP marker developed based on SNP loci could be used to explore new germplasm carrying the Bph43 gene and molecular marker assisted selection breeding for resistance to brown planthopper.

Key words： rice； brown planthopper（Nilaparvata lugens）； Bph43； KASP marker； breeding for resistance to brown planthopper

水稻是中國最重要的糧食作物之一。褐飛虱（Nilaparvata lugens）是水稻單食性、刺吸式口器害蟲，通過口針吸食水稻韌皮部中的汁液。褐飛虱的輕度危害可導致水稻植株生長活力降低、產量下降；重度危害可導致水稻全株死亡，甚至顆粒無收。全國農業技術推廣服務中心對2006—2015年農作物主要病蟲害發生危害情況的統計和分析表明，中國年平均發生稻飛虱（最主要的是褐飛虱）面積為0.002 6億km2次，每年因稻飛虱危害造成的損失位居水稻病蟲害之首，占水稻病蟲害總損失的29.51%［1］。褐飛虱也在泰國、越南等亞洲各國大面積發生，每年造成幾十億美元的經濟損失，導致了2007—2008年全球大米危機［2］。褐飛虱已成為水稻生產中發生面積最大、造成危害最嚴重的害蟲。因此，遏制褐飛虱的發展和危害對保障糧食安全、推動農業可持續發展具有重要意義。

實踐證明，農作物病蟲害綜合治理與持續控制的基礎是選育和種植抗性品種。利用作物自身抗病蟲基因培育抗病蟲新品種是病蟲害防治中最經濟有效和環境友好的措施，也是未來農業綠色發展的必由之路［3］。目前從栽培稻和野生稻資源中鑒定出的抗褐飛虱基因超過40個，其基因資源和分子標記正應用于抗褐飛虱分子標記輔助選擇育種中［4］。袁隆平農業高科技股份有限公司應用Bph6和Bph9培育出通過國家審定的超級雜交中稻品種瑋兩優7713，抗褐飛虱3級。在中華人民共和國農業農村部組織的超級稻測產驗收中，瑋兩優7713平均產量達1 083.6 kg/666.7 m2，且未發現稻飛虱危害。推廣和應用抗褐飛虱水稻品種，對防治褐飛虱危害發揮重要作用。

水稻和褐飛虱在長期的協同進化過程中，水稻形成了抗性基因，而褐飛虱在水稻抗性基因的選擇壓力下可發生致害性變異。目前已報道的褐飛虱生物型有10余種，且致害能力有逐漸增強的趨勢［5］。褐飛虱致害性變異導致水稻抗性喪失是褐飛虱持續防控面臨的潛在挑戰。為應對褐飛虱生物型變異，需進一步發掘水稻種質資源中新的抗褐飛虱基因。前期從抗源IRGC 8678中發掘并精細定位了新型廣譜抗褐飛虱基因Bph43［6］。本研究進一步開發與Bph43緊密連鎖且特異的KASP標記，并在水稻自然群體與基因分離群體中進行驗證，為Bph43在抗褐飛虱分子標記輔助選擇育種中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的Bph43基因供體親本IRGC 8678來源于國際水稻研究所，珞揚9號、9311以及9311/IRGC 8678//9311的BC1F2群體來源于雜交水稻全國重點實驗室，其余供試材料來源于袁隆平農業高科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 取供試水稻品種苗期幼嫩葉片，采用CTAB法提取水稻高質量基因組DNA［7］。并將基因組DNA溶解于TE 緩沖液，用于后續的重測序或KASP標記基因型檢測。

1.2.2 基因組重測序 為保證文庫構建質量，首先對IRGC 8678基因組DNA質量進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示基因組DNA主帶完整清晰，且無降解和RNA污染。Nanodrop檢測OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.2，無蛋白質污染。質檢合格的基因組DNA，嚴格按照NEBNext? Ultra? II FS DNA Library Prep Kit for Illumina?中提供的方法進行文庫構建。使用Qubit 3.0軟件對構建完成的文庫進行初步定量，利用Agilent 2100檢測文庫插入片段大小，再通過ANALYTIKJENA QTOWER 實時熒光定量PCR儀對文庫的有效濃度進行準確定量，有效濃度＞2 nmol/L為合格文庫。最后按照目標下機數據量對文庫進行pooling，用Illumina HiSeq X TEN平臺進行Paired-end 150 bp（PE150）測序。水稻基因組重測序由武漢基諾賽克科技有限公司完成。

1.2.3 KASP標記開發 對測序獲得的原始數據（raw data 或raw reads），使用Cutadapt軟件（version 1.13）去除reads中含有的接頭序列，使用Trimmomatic軟件（version 0.36）去除reads中的低質量堿基。使用BWA軟件（version 0.7.15-r1140）的MEM算法將測序數據與日本晴參考基因組（版本號IRGSP 1.0）進行比對，得到SAM格式的比對結果［8］。使用Samtools軟件（version 1.3.1）將SAM格式文件轉換成BAM格式，用Picard工具（version 1.91）中的SortSam對BAM文件中的reads進行排序，并使用Samtools的rmdup去除PCR重復，最終得到的BAM文件，用于覆蓋度和覆蓋深度統計以及variant calling［9］。最后，應用GATK（version 3.7）軟件包中的GenotypeGVCFs模塊進行SNP變異檢測［10］。進而調出Bph43基因精細定位區間對應日本晴參考基因組（版本號IRGSP1.0）第11號染色體16 642 878 bp至16 918 771 bp的SNP，進一步結合3 000份水稻測序公共數據庫資源分析SNP位點的分布頻率，篩選出Bph43基因緊密連鎖區間特有的SNP位點。以獲得的Bph43區間特有的SNP位點為靶點，分別獲取其在日本晴參考基因組上下游各200 bp的序列進行KASP引物設計，對設計的KASP引物進行PCR擴增，測試引物的分型效果。

1.2.4 KASP標記分型 以待測水稻基因組DNA作為模板，利用KASP標記K_11674982、K_11775428和K_11856768進行KASP反應檢測。PCR擴增反應體系以2 μL計：1 μL模板DNA，100 μmol/L的Fam和Hex引物各0.007 μL，100 μmol/L的Com引物0.015 μL，以2×KASP Master Mix補足至總體積2 μL。PCR擴增反應條件：反應在水浴熱循環儀中完成，第一步擴增反應，94 ℃預變性15 min，94 ℃變性20 s，65～57 ℃退火并延伸60 s，10個循環，每個循環退火及延伸的溫度降低0.8 ℃；第二步擴增反應，94 ℃變性20 s，57 ℃退火并延伸60 s，26個循環。反應完成后利用LGC IntelliQube基因分型平臺對PCR反應產物進行熒光掃描和基因分型。KASP標記PCR產物檢測到Hex熒光信號，表明待測水稻樣品中含純合抗褐飛虱基因Bph43；若檢測到Fam熒光信號，表明待測水稻樣品不含抗褐飛虱基因Bph43；若同時檢測到Fam熒光和Hex熒光，則表明待測水稻樣品中Bph43為雜合型。

2 結果與分析

2.1 Bph43緊密連鎖的KASP標記開發

Bph43基因精細定位區間對應日本晴參考基因組（版本號IRGSP 1.0）第11號染色體16 642 878 bp至16 918 771 bp的SMP。將Bph43基因供體親本IRGC 8678進行30X覆蓋的基因組重測序，與日本晴參考基因組序列進行對比，獲取Bph43緊密連鎖區間內SNP變異位點。進一步利用3 000份水稻測序公共數據庫資源分析SNP位點的分布頻率，篩選Bph43基因緊密連鎖區間特有的SNP位點。最終將位于參考基因組（IRGSP1.0）日本晴第11號染色體11 674 982、11 775 428、11 856 768 bp處的SNP位點作為靶點，設計相應的KASP標記K_11674982（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點為T等位，其余水稻資源在該位點為A等位）、K_11775428（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點為T等位，其余水稻資源在該位點為C等位）和K_11856768（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點為G等位，其余水稻資源在該位點為A等位）。KASP引物序列見表1。3個KASP標記檢測Bph43抗蟲等位的引物序列都帶有Hex標簽序列，而檢測Bph43感蟲等位的引物序列都帶有Fam標簽序列，因此在利用3個KASP標記PCR擴增攜帶純合Bph43的水稻樣品時可產生Hex熒光信號，擴增不含Bph43的水稻樣品產生Fam熒光信號，而雜合型水稻樣品可產生Fam和Hex 2種熒光信號。

2.2 Bph43 KASP標記在水稻自然群體的驗證

為了驗證Bph43緊密連鎖的KASP標記在水稻自然群體中的適用性和通用性，本研究應用K_11674982、K_11775428和K_11856768對Bph43基因供體親本IRGC 8678、含Bph9基因的珞揚9號以及其他64份水稻品種進行鑒定。標記的分型效果如圖1所示，本研究開發的3個KASP標記均在Bph43基因供體親本IRGC 8678中檢測到強的Hex熒光信號，即含Bph43純合基因型；在含Bph9基因的珞揚9號、其他64份水稻品種檢測到強的Fam熒光信號，表明這些水稻品種不含Bph43。親本基因型結果（表2）表明，3個KASP熒光標記具有較強的特異性，能準確檢測出水稻中是否含有Bph43基因，這將有助于發掘攜帶Bph43基因的新種質，并提高Bph43基因在抗褐飛虱育種中的利用率。

2.3 Bph43 KASP標記在分離群體的驗證

本研究進一步利用開發的3個Bph43 KASP標記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）對9311/IRGC8678//9311的BC1F2群體中的200個單株進行基因型分型。結果（圖2）表明，3個KASP標記Bph43基因型檢測結果均一致（一一對應），3種不同基因型Bph43純合（Hex熒光信號，藍色標記點）、Bph43雜合（同時檢測到Fam和Hex熒光信號，紫色標記點）以及bph43純合（不含Bph43，Fam熒光信號，紅色標記點）的分離比為45∶106∶49，經卡方檢驗符合1∶2∶1的孟德爾單基因分離比（χ2＝0.88lt;χ20.05＝5.99）。3個KASP標記是共顯性標記，可以將2種不同的純合子以及雜合子區分開，檢測位點同時表現為單基因分離。

為了進一步明確KASP標記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）檢測的BC1F2材料基因型與其抗褐飛虱表型是否一致，各隨機選擇經KASP標記確定的20份Bph43純合基因型、20份Bph43雜合基因型以及20份不含Bph43的BC1F2材料。將BC1F2材料進行自交，得到對應的BC1F23材料，采用苗期集團法考察60份BC1F23材料的抗性表現（以BC1F23家系抗性級別代表BC1F2單株的抗褐飛虱表型）。Bph43純合基因型BC1F2材料平均抗性值均為2.5，抗褐飛虱；Bph43雜合基因型BC1F2材料平均抗性值在4.1～4.5，對褐飛虱表現為雜合抗性；不含Bph43的BC1F2材料均對褐飛虱表現為感性，抗性值約為9。結果表明，3個Bph43 KASP標記基因型與抗褐飛虱表型完全符合，可應用于Bph43的分子標記輔助選擇育種實踐。

3 小結與討論

褐飛虱是水稻生產中發生面積最大、造成危害最嚴重的害蟲。遏制褐飛虱的發展和危害對保障中國糧食安全具有重要意義。實踐證明，培育和種植抗褐飛虱水稻品種是褐飛虱綜合防治的基礎。新的《主要農作物品種審定標準（國家級）》強調品種安全性，突出綠色發展，要求對華南稻區、長江上游稻區及長江中下游稻區水稻褐飛虱抗性進行鑒定，且抗蟲品種可作為綠色優質品種進行分類審定。而培育抗蟲水稻品種的關鍵在于稻種資源中所蘊藏的抗褐飛虱基因。目前已從栽培稻和野生稻資源中鑒定了40多個抗褐飛虱基因［4］，其中，較多的抗褐飛虱基因成簇分布在染色體相同或者相近的區域，大多是同一基因或同一基因的等位變異，能在生產上大面積使用的抗褐飛虱基因并不多，加上褐飛虱存在生物型變異，因此，仍需發掘更多具有重大育種應用價值的抗褐飛虱新基因。

傳統的水稻抗蟲育種是通過抗蟲性狀鑒定對植株進行表型選擇。由于水稻材料抗蟲性鑒定的復雜性，利用常規育種手段進行抗蟲基因的轉育效率較低。抗褐飛虱基因定位或克隆后，與抗褐飛虱基因緊密連鎖的分子標記、基因特異性分子標記或基因功能標記已經或正在應用于抗褐飛虱分子標記輔助選擇育種中［11-16］。這些標記大多為SSR或者InDel標記，依賴于瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，試驗費時費力。本研究在前期從抗源IRGC 8678中發掘并精細定位其中的新型廣譜抗褐飛虱基因Bph43基礎上，通過抗褐飛虱基因Bph43親本材料的基因組重測序，將與Bph43緊密連鎖或共分離的區域序列，與3 000份水稻測序公共數據庫資源進行對比分析，篩選出Bph43緊密連鎖區間稀有或特有的SNP位點，開發出Bph43特異的KASP標記。相對于傳統的分子標記，KASP標記不需要進行電泳，可通過熒光掃描直接讀取基因型的信號實現基因分型，具有穩定性好、準確性高、檢測效率高、檢測成本低等優勢。水稻自然群體與基因分離群體的驗證結果表明，本研究開發的Bph43特異KASP標記是共顯性標記，標記基因型分析結果與抗褐飛虱表型符合，能特異、準確地檢測出水稻中是否含有Bph43基因，可準確進行Bph43基因的導入和聚合，高效選育含Bph43基因的抗褐飛虱水稻品種，從而為少打農藥、減少糧食損失、發展環境友好型和資源節約型農業做出重要貢獻。

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收稿日期：2022-05-20

基金項目：深圳市基礎研究項目（JCYJ20180302173435080）

作者簡介：鄧 釗（1989-），男，湖南邵陽人，在讀博士研究生，研究方向為水稻分子遺傳育種，（電話）18508420628（電子信箱）470571084@qq.com；通信作者，楊遠柱（1962-），男，湖南懷化人，研究員，主要從事雜交水稻育種研究，（電話）13607442126（電子信箱）yzhuyah@163.com；陳榮智（1976-），男，重慶人，副教授，博士，主要從事水稻抗褐飛虱基因發掘與利用研究，（電話）15972013776（電子信箱）rzchen@whu.edu.cn。