刺槐素干預陣發性心房顫動小鼠的量效及作用機制研究

摘要 目的：探討不同劑量刺槐素對陣發性心房顫動小鼠的作用及其電生理機制。方法：動物實驗中，將48只C57/BL6J小鼠隨機分為空白組、模型組、胺碘酮組、刺槐素低劑量組（12 mg/kg）、刺槐素中劑量組（24 mg/kg）、刺槐素高劑量組（48 mg/kg），每組8只。連續給藥3 d后，腹腔注射0.5 mg/kg鹽酸異丙腎上腺素，1 min后給予電刺激（連續單刺激，電壓0.08 V，頻率90 Hz）21 min，測量并統計小鼠心房顫動發作總時間。細胞實驗中，選取中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1），通過轉染小鼠Kv1.5質粒，運用膜片鉗全細胞記錄技術，觀察刺槐素對mKv1.5的作用。結果：動物實驗發現，與空白組相比，模型組心房顫動持續時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組相比，刺槐素高劑量組、胺碘酮組心房顫動持續時間明顯縮短（P＜0.05）。刺槐素呈劑量依賴性抑制小鼠心房顫動發作，半數抑制濃度為4.235 mg/kg。細胞實驗發現刺槐素可抑制中國倉鼠卵巢細胞Kv1.5通道的峰值電流幅度，并呈電壓依賴性地抑制Kv1.5通道電流，對Kv1.5通道的電流穩態激活曲線門控機制無明顯作用。結論：刺槐素呈劑量依賴性抑制小鼠心房顫動發作，其機制可能是阻斷超快速延遲整流鉀通道有關。

關鍵詞 心房顫動；刺槐素；超快速延遲整流鉀通道；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.009

Mechanism of Acacetin in Treatment of Paroxysmal Atrial Fibrillation in Mice

CHEN Sijing， XU Yao， QI Jianyong， YU Juan

The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， Guangdong， China

Corresponding Author YU Juan， E-mail： 514203028@qq.com

Abstract Objective：To investigate the effects of different doses of Acacetin on mice with atrial fibrillation and its electrophysiological mechanism.Methods：Forty-eight C57/BL6J mice were randomly divided into 3 groups：blank group，model group，Amiodarone group，Acacetin low dose group（12 mg/kg），Acacetin medium dose group（24 mg/kg），and Acacetin high dose group（48 mg/kg），with 8 mice in each group.After 3 days of continuous treatment，0.5 mg/kg of isoprenaline hydrochloride was injected intraperitoneally，and electrical stimulation（continuous single stimulation，0.08 V，90 Hz） was given for 21 minute，and the total time of atrial fibrillation episodes in mice was measured and counted.Chinese hamster ovary cells were selected and transfected with mouse Kv1.5 plasmid，and the effect of Acacetin on mKv1.5 was observed by membrane clamp whole cell recording technique.Results：The duration of atrial fibrillation was significantly prolonged in model group compared with that in blank group（P＜0.01），and the duration of atrial fibrillation was significantly shortened in Acacetin high dose group and the Amiodarone group compared with model group（P＜0.05）.The half-inhibitory concentration was 4.235 mg/kg.Cellular experiments revealed that Acacetin inhibited the peak current amplitude of Kv1.5 channels in Chinese hamster ovary cells and suppressed Kv1.5 channel currents in a voltage-dependent manner，without significant effect on the current steady-state activation curve gating mechanism of Kv1.5 channels.Conclusion：Acacetin inhibited paroxysmal atrial fibrillation in mice in a dose-dependent manner，and the mechanism may be related to the blockade of ultra rapid delayed rectifier potassium current.

Keywords " atrial fibrillation; Acacetin; ultra rapid delayed rectifier potassium current; experiment research

基金項目 廣東省自然科學基金項目（No.2020A1515010777）

作者單位 1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院（廣州 510006）；2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院；3.廣州中醫藥大學第二附屬醫院重癥醫學中醫藥應用研究團隊；4.廣東省中醫科學院公共實驗室（廣州 510120）

通訊作者 于娟，E-mail：514203028@qq.com

引用信息 陳思靜，徐耀，祁建勇，等.刺槐素干預陣發性心房顫動小鼠的量效及作用機制研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2391-2395.

心房顫動表現為胸悶、心悸、乏力、運動耐量下降，甚至可誘發心力衰竭、心室停搏。估計到2050年，僅亞洲就將有7 200萬例心房顫動病人，心房顫動相關的中風病人約有290萬例^[1-2]。其中血栓和腦卒中為最常見的并發癥，我國心房顫動病人腦卒中總體發生率達24.8%^[3]，致死率及致殘率分別約為20%和60%^[4]，這使得我國心房顫動及相關中風負擔明顯增加。心房顫動發生與心房肌細胞離子通道改變有關。刺槐素為中藥“雪蓮”的主要活性成分，研究顯示，刺槐素可選擇性抑制超快速激活的延遲整流鉀通道（IKur）^[5]，為理想的抗心律失常藥物。本研究以小鼠心房顫動發作總時間為觀察指標，探究刺槐素治療心房顫動的具體量效關系及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：No.WS20051129）；鹽酸異丙腎上腺素（大連美倫生物技術有限公司，批號：A1010A）。

1.2 藥物

刺槐素（西安康諾化工有限公司，批號：PB220030802）；胺碘酮（賽諾菲，批號：CA078）。

1.3 儀器

RM6240C型多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠）；針灸針（蘇州醫療用品有限公司，型號：0.25 mm×13 mm）；軟玻璃毛細管（Sutter Instrument，批號：BF170-96-10）；HEKA-10放大器（HEKA，Germany）。

1.4 動物

健康雄性無特定病原體（SPF）級C57/BL6J小鼠48只，體質量20～30 g，廣東斯嘉景達生物科技有限公司，合格證號：44825400001250。本研究經廣東省中醫院倫理委員會審核通過（編號：2020052）。

1.5 細胞

中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1），轉染mKv1.5-egfp質粒。

1.6 實驗方法

1.6.1 動物造模方法

小鼠腹腔注射75 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后仰臥置于固定板固定，導聯轉換器、刺激器接針灸針，導聯轉換器端刺入接小鼠右上肢、右下肢、左上肢，刺激器端分別刺入左下肢和胸口心臟搏動最劇烈處，詳見圖1。將導聯轉換器和刺激器接入RM6240多道生理信號采集處理系統，全程描記小鼠心電圖。腹腔注射0.5 mg/kg鹽酸異丙腎上腺素（空白組注射同等體積生理鹽水），1 min后給予電刺激21 min，連續單刺激電壓0.08 V，頻率90 Hz，波寬5 ms，延時0 ms。電刺激結束后持續觀察和記錄15 min，15 min內小鼠心電圖出現典型心房顫動改變（即RR間期連續不等）為成功誘發心房顫動。詳見圖2。

1.6.2 分組及給藥方法

將體質量均衡的小鼠隨機分為空白組、模型組、胺碘酮組、刺槐素低劑量組（12 mg/kg）、刺槐素中劑量組（24 mg/kg）、刺槐素高劑量組（48 mg/kg），每組8只。刺槐素低劑量組、刺槐素中劑量組、刺槐素高劑量組以12、24、48 mg/kg相應劑量刺槐素懸液灌胃，每日1次，連續灌胃3 d；空白組、模型組以同等體積純凈水灌胃，每日1次，連續灌胃3 d。胺碘酮組于心房顫動出現后腹腔注射5 mL（31.2 mg/kg，相當于成人劑量的每次300 mg）。

1.6.3 心房顫動發作時間測量方法

使用RM6240C型多道生理信號采集處理系統的標尺標測每次心房顫動發作的持續時間，以典型心房顫動心電圖（連續3個RR間期不等，P波消失代之以鋸齒狀f波）為起始點，以恢復竇性心律為終點。若出現其他心律失常（如心室顫動、室性心動過速等）也視為心房顫動結束。并使用Excel統計每只小鼠15 min內心房顫動發作的總時間。

1.6.4 細胞實驗

選用第20代～第40代CHO-K1細胞，運用Lipofectin2000轉染Kv1.5-egfp質粒至CHO-K1細胞，6 h后更換細胞外液，24～48 h后予以行膜片鉗檢測Kv1.5通道電流。

1.6.5 膜片鉗技術檢測

玻璃電極經兩步拉制法拉制而成，其尖端電阻為3～5 MΩ。記錄Kv1.5電流內液成分：KCl 140 mmol/L，CaCl₂ 1 mmol/L，MgCl₂ 1 mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10 mmol/L，乙二醇雙四乙酸（EGTA）10 mmol/L（用KOH調至pH 7.3）；記錄Kv1.5電流細胞外液：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl₂ 1 mmol/L，MgCl₂ 1 mmol/L， HEPES 10 mmol/L（用NaOH調至pH 7.3）。將刺槐素溶解在無菌蒸餾水中作為 10 mmol/L的儲備溶液，然后用細胞外溶液稀釋至所需濃度。

玻璃電極通過探頭連接HEKA-10放大器，玻璃電極接觸在細胞表面，給予一定負壓使細胞吸附至電極尖端形成高阻封接后，繼續予負壓吸破細胞膜，形成全細胞記錄，通過Patchmaster發放指令脈沖和采集數據，Fitmaster分析數據。所有實驗均在室溫（23～25 ℃）下進行。

1.7 統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s） 表示，采用ANOVA方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 刺槐素對小鼠心房顫動持續時間的影響

與空白組相比，模型組心房顫動持續時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組相比，刺槐素高劑量組、胺碘酮組心房顫動持續時間明顯縮短（P＜0.05）。刺槐素呈劑量依賴性抑制小鼠心房顫動發作，半數抑制濃度（IC50）為4.235 mg/kg。詳見圖3～圖5。

2.2 刺槐素對CHO-K1細胞mKv1.5通道的影響

2.2.1 刺槐素對Kv1.5通道的峰值電流幅度的影響

CHO-K1細胞Kv1.5通道電流可由鉗制電位－80 mV，從－50 mV到50 mV給予去極化脈沖刺激，階躍為10 mV，持續時間為250 ms的去極化脈沖引出（見圖6A）。10 μmol/L刺槐素可明顯抑制Kv1.5通道的峰值電流幅度（見圖6B）。Kv1.5通道激活閾值在－40 mV左右，刺槐素在－30 mV以上各電壓下均可抑制通道電流，并隨著去極化程度改變，抑制能力進一步增強，呈電壓依賴性，詳見圖7A。50 mV時，10 μmol/L刺槐素可明顯抑制CHO-K1 Kv1.5通道的峰值電流幅度（P＜0.01），詳見圖7B。

2.2.2 刺槐素對Kv1.5通道的電流穩態激活曲線的影響

對于穩態激活，膜電位鉗制在－80 mV，去極化從－60 mV至50 mV，階躍為10 mV電壓，持續250 ms。與對照組相比，刺槐素活化參數沒有明顯變化（見圖8A）。在－20 mV至50 mV，與對照組相比，激活時間常數沒有明顯變化（見圖8B）。

3 討 論

本研究證明刺槐素對心房顫動小鼠具有劑量依賴性保護作用，并可能通過阻斷超快速延遲整流鉀通道，延長心肌細胞動作電位和不應期以縮短心房顫動發作時間。本研究采用異丙腎上腺素合并電刺激誘導心房顫動的小鼠模型，結果顯示，空白組與模型組心房顫動發作總時間有明顯差異，表明造模成功且異丙腎上腺素在造模過程中起關鍵作用。異丙腎上腺素激動β受體，增強心肌收縮，增加心肌耗氧量，引起心肌缺血；誘導心肌組織氧化應激，產生活性氧，損傷心肌細胞，造成心臟毒性，梗死區域的心肌細胞逐漸被膠原蛋白取代，心臟纖維化程度增加^[6]。異丙腎上腺素還可以激活環磷酸鳥苷（cAMP）/蛋白激酶 A（PKA）信號通路，從而引起鈣超載，鈉離子流（INa）、鉀離子流（IK）增強^[7]。Sampson等^[8]研究表明，激動異丙腎上腺素受體可調節內向整流鉀電流（IKs）通道，導致動作電位失衡縮短，從而誘發房性心律失常。此外異丙腎上腺素引起炎癥、鈣超載、能量代謝改變等^[9]，為心房顫動的發生提供了條件。電刺激可引起心房離子通道的改變，導致心房電重構，促進小鼠心房顫動的發生。該模型具有快速簡單、經濟實惠、低死亡率和高重復性的特點，適用于抗心房顫動藥物的篩選及作用機制研究。目前心房顫動小鼠模型的建立主要有3種方法：藥物誘導、基因修飾、電刺激^[10]。藥物誘導一般通過尾靜脈注射氯化鈣-乙酰膽堿混合溶液誘發自發性心房顫動，本研究造模方法與上述3種方法不同：1）造模周期短，注射異丙腎上腺素及電刺激后15 min內即可觀察到心房顫動；2）操作簡單，小鼠尾靜脈細小，注射難度大，注射藥量不精準，本模型只需腹腔注射，藥物起效迅速，簡單快捷，可重復性高；3）電刺激一般使用食管置入電極的方法，相比電刺激，本模型定位更加準確，并且心電圖不易受其他因素（如胃內容物）影響。但是溫度、光照、配制時間等因素均可影響異丙腎上腺素藥效，從而影響實驗的穩定性，提示實驗人員必須重視異丙腎上腺素的配制及保存；此外小鼠電刺激的位置及深度容易偏離，要求實驗人員對小鼠心臟的解剖位置有清晰的了解。

IKur是一種心肌復極化電流，由Kv1.5編碼，而IKur僅存在于心房肌細胞中，心室中不含有這種電流。IKur的阻斷將選擇性地減慢心房復極化并延長不應期，但對心室的復極化無影響。在抑制心房顫動同時不誘發其他部位心律失常發生，因此，被認為是發展選擇性治療心房顫動藥物的靶點^[11]。Sridhar等^[12]研究顯示，在心力衰竭心房顫動犬模型中，Kv1.5通道蛋白表達水平及IKur電流密度下降，導致動作電位、有效不應期縮短，從而誘發心房顫動。

刺槐素，又稱金合歡素（5，7-二羥基-4′-甲氧基黃酮），存在于雪蓮、刺槐、野菊花等多種植物中，具有抗炎、抗癌、抗肥胖、神經保護、心臟保護等作用^[13]。Li等^[5]應用全細胞膜片鉗技術，研究刺槐素對IKur其他強心離子流的影響，發現刺槐素可明顯抑制人類心房的IKur及暫時外向鉀離子電流（It₀），IC50分別為3.2、9.2 μmol/L。同時，刺槐素在 3、10 μmol/L時基本抑制了卡巴膽堿誘發的豚鼠心房肌細胞乙酰膽堿活化的鉀離子電 流（IKAch），從而延長了迷走神經緊張引起的心房動作電位時程和有效不應期。而且30～100 μmol/L刺槐素對豚鼠心室肌細胞的INa、L-型鈣離子流（ICaL）和內向整流鉀電流（IKs）均沒有抑制作用，表明其作用具有選擇性，使用安全。此外，刺槐素可選擇性抑制IKur、It0、IKACh，延長麻醉狗的動作電位時程和有效不應期，但不延長QT間期，且最大經口劑量為900 mg/kg時小鼠無死亡，表明刺槐素的毒性很低^[5]；并通過進一步研究發現，刺槐素通過Kv1.5和Kv4.3通道的使用和速率依賴性阻斷以有利于抗心房顫動^[14-15]。

本研究結果證明，刺槐素具有劑量依賴性保護作用，并可呈電壓依賴性抑制Kv1.5通道電流，提示刺槐素可能通過阻斷IKur發揮作用。與胺碘酮相比，刺槐素具有不良反應小、毒性低等優點。胺碘酮可引起竇性心律過緩、房室傳導阻滯，甚至心臟停搏等不良反應。而研究已經證實刺槐素可縮短動作電位時程、有效不應期的同時不延長QT間期，且能選擇性地抑制心房鉀離子通道^[5]。故刺槐素可能是一種新型有效的抗心房顫動藥物。

本研究證明刺槐素對心房顫動小鼠具有劑量依賴性保護作用，并可能通過阻斷超快速延遲整流鉀通道，從而對小鼠陣發性心房顫動具有劑量依賴性保護作用，為刺槐素治療心房顫動提供研究基礎。

參考文獻：

[1] KORNEJ J，BRSCHEL C S，BENJAMIN E J，et al.Epidemiology of atrial fibrillation in the 21st century：novel methods and new insights[J].Circulation Research，2020，127（1）：4-20.

[2] CHIANG C E，WANG K L，LIP G Y.Stroke prevention in atrial fibrillation：an Asian perspective[J].Thrombosis and Haemostasis，2014，111（5）：789-797.

[3] 胡盛壽.中國心血管健康與疾病報告2019概要[J].中國循環雜志，2020，35（9）：833-854.

[4] 黃從新，張澍，黃德嘉，等.心房顫動：目前的認識和治療的建議-2018[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2018，32（4）：315-368.

[5] LI G，WANG H，QIN G，et al.Acacetin，a natural flavone，selectively inhibits human atrial repolarization potassium currents and prevents atrial fibrillation in dogs[J].Circulation，2008，117（19）：2449-2457.

[6] ALLAWADHI P，KHURANA A，SAYED N，et al.Isoproterenol-induced cardiac ischemia and fibrosis：plant-based approaches for intervention[J].Phytotherapy Research，2018，32（10）：1908-1932.

[7] GRANDI E，RIPPLINGER C M.Antiarrhythmic mechanisms of beta blocker therapy[J].Pharmacological Research，2019，146：104274.

[8] SAMPSON K J，TERRENOIRE C，CERVANTES D O，et al.Adrenergic regulation of a key cardiac potassium channel can contribute to atrial fibrillation：evidence from an IKs""""""""""""" transgenic mouse[J].The Journal of Physiology，2008，586（2）：627-637.

[9] WONG Z W，THANIKACHALAM P V，RAMAMURTHY S.Molecular understanding of the protective role of natural products on isoproterenol-induced myocardial infarction：a review[J].Biomedicine amp; Pharmacotherapy，2017，94：1145-1166.

[10] 戴瑋然，鐘國強.鼠心房顫動模型現狀及小鼠轉錄調控心房顫動模型的運用[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2020，34（5）：488-492.

[11] AGUILAR M，FENG J L，VIGMOND E，et al.Rate-dependent role of IKur in human atrial repolarization and atrial fibrillation maintenance[J].Biophysical Journal，2017，112（9）：1997-2010.

[12] SRIDHAR A，NISHIJIMA Y，TERENTYEV D，et al.Chronic heart failure and the substrate for atrial fibrillation[J].Cardiovascular Research，2009，84（2）：227-236.

[13] WU C X，YAN J H，LI W.Acacetin as a potential protective compound against cardiovascular diseases[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine：ECAM，2022，2022：6265198.

[14] WU H J，WU W，SUN H Y，et al.Acacetin causes a frequency- and use-dependent blockade of hKv1.5 channels by binding to the S6 domain[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2011，51（6）：966-973.

[15] WU H J，SUN H Y，WU W，et al.Properties and molecular determinants of the natural flavone acacetin for blocking hKv4.3 channels[J].PLoS One，2013，8（3）：e57864.

（收稿日期：2022-11-04）

（本文編輯郭懷印）