麝香保心丸通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11減輕心肌缺血再灌注損傷的實驗研究

摘要 目的：探討麝香保心丸干預心肌缺血再灌注（I/R）損傷大鼠的作用機制。方法：將20只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為control組、I/R組、I/R＋麝香保心丸組、I/R＋鐵抑素-1（Fer-1）組，每組5只。對照組及I/R組給予生理鹽水2 mL/d灌胃，I/R＋麝香保心丸組給予麝香保心丸150 mg/（kg·d）灌胃，I/R＋Fer-1組大鼠腹腔注射1 mg/（kg·d）Fer-1，5 d后制備心肌缺血再灌注模型，control組僅開胸后縫合。再灌注24 h后檢測大鼠心功能以及外周血肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白T水平；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌的病理情況。結果：麝香保心丸及Fer-1均可改善模型大鼠心功能，降低外周血CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平（P＜0.05），下調(diào)心肌miR-144-3p，提高SLC7A11蛋白及谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）表達水平（P＜0.05）。HE染色提示Fer-1或麝香保心丸預干預可以減輕I/R心肌細胞排列混亂，縮小細胞組織間隙。結論：麝香保心丸可以減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能與miR-144-3p/SLC7A11信號通路，減輕心肌細胞鐵死亡有關。

關鍵詞 缺血再灌注損傷；麝香保心丸；鐵死亡；心功能；谷胱甘肽；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.010

基金項目 上海市醫(yī)學重點專科項目（No.ZK2019A11）；上海市普陀區(qū)優(yōu)勢學科項目（No.2019ysxk01）；上海市中醫(yī)藥傳承和科技創(chuàng)新項目（No.ZYCC2019026）；中華中醫(yī)藥學會青年人才托舉工程項目（No.QNRC2-B03）；上海市普陀區(qū)衛(wèi)生健康系統(tǒng)科技創(chuàng)新項目（No.ptkwws202209）；上海中醫(yī)藥大學預算內(nèi)項目（No.2021LK054）

作者單位 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院（上海 200062）

通訊作者 李凌燕，E-mail：4707494@qq.com

引用信息 葉健，汪谞，席鑫，等.麝香保心丸通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11減輕心肌缺血再灌注損傷的實驗研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2396-2399.

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是嚴重威脅人類健康的疾病，具有高致殘率、致死率，發(fā)病率仍逐年上升^[1]。迅速開通堵塞血管是降低死亡率、改善預后的重要手段，但無論是介入還是溶栓治療都無法避免再灌注損傷。缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）是由于血流恢復后損傷進一步加重的情況，具體機制尚不明確，其中包含了以壞死和細胞程序性死亡為主的多種細胞損傷和死亡模式^[2]。在縮短血管開通時間的前提下，減輕I/R是改善病人預后的重要手段。鐵死亡是一種以鐵沉積和脂質(zhì)過氧化物為特征，有別于凋亡、壞死的細胞程序性死亡方式^[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在心肌I/R中起重要作用，抑制鐵死亡能減輕再灌注心肌損傷^[4]。

麝香保心丸是治療冠心病的常用藥物，來源于宋代《太平惠民和劑局方》所記載的蘇合香丸。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有心肌重構、改善血管內(nèi)皮功能、促進血管新生、縮小斑塊及改善心肌I/R等多重作用^[5-7]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可以通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號通路減輕心肌細胞鐵死亡^[8]，但其減輕心肌I/R是否與該信號通路有關不得而知，本研究旨在明確麝香保心丸改善心肌I/R是否與調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號通路抑制鐵死亡有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑及動物

20只SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（序號：0043893），所有動物遵循動物實驗倫理，給予充足的食物、飲水，飼養(yǎng)在溫度18～26 ℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境中。麝香保心丸（上海和黃藥業(yè)）用無菌生理鹽水制成混懸液，SLC7A11抗體購自Abcam，鐵抑素-1（Fer-1）購自Sigma，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒及發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術公司，蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒由上海萊哲生物科技有限公司提供。

1.2 I/R模型構建及分組

3%的戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射，頸部及胸腔毛發(fā)剪除消毒，頸部中間開口1 cm，胸骨舌骨肌止血鉗鈍性分離暴露氣管，顯微剪刀切開小口，開口不宜過大，插入呼吸機插管，呼吸機參數(shù)：呼吸頻率90次/min，呼吸比為1∶2，生理鹽水棉球蓋住創(chuàng)口。于第3肋與第4肋骨間（可手按胸腔感知心臟跳動最明顯位置）皮膚開口1 cm，下行處有一條小靜脈可兩端止血鉗夾住10 s，用剪刀剪斷，肋間開小口0.5 cm。兩個撐開器上下左右以肋骨配合撐開，暴露心臟，止血鉗挑開心包膜，再夾住胸腺部位固定，另一只手持針（5-0縫合線）左心耳下方3 mm處進針，深度1 mm，寬度2 mm扎針進線后在上方放一根直徑0.53 mm、長5 cm魚線，活結結扎。縫合閉胸，2 h后輕抽魚線再灌注。術后每只大鼠給予8×10⁵ U青霉素0.5 mL抗炎。再灌注24 h后進行后續(xù)實驗。

采用隨機數(shù)字表法分為control組、I/R組、I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組，每組5只。control組及I/R組給予生理鹽水2 mL/d灌胃，I/R＋麝香保心丸組給予麝香保心丸150 mg/（kg·d）灌胃，I/R＋Fer-1組大鼠腹腔注射1 mg/（kg·d）Fer-1，5 d后制備心肌I/R模型，control組僅開胸后縫合。

1.3 心功能檢測

采用PHILIPS CX50超聲系統(tǒng)檢測左心室射血分數(shù)（LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）。3%戊巴比妥麻醉后，將大鼠備皮并固定在手術臺上，將線陣探頭放在胸骨左側(cè)，采集最佳的二維圖像，清晰顯示心尖及左右房室腔切面、左心室長軸，以看到M型曲線為準。檢測心功能相關指標，并計算LVEF，取連續(xù)心動周期的平均值作為最后結果進行統(tǒng)計學分析。

1.4 心肌組織處理

取出心臟組織標本，清洗后，一部分用4%的多聚甲醛溶液固定，包埋在石蠟中，采用HE染色觀察心肌病理情況；留取部分心肌組織－80 ℃凍存。

1.5 血清學指標

3%戊巴比妥麻醉后，5 mL注射器腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min，參考說明書，用ELISA試劑盒檢測大鼠外周血肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白T濃度。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測各組miR-144-3p表達水平

取出－80 ℃中剩余心肌組織，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照說明書進行RT-PCR反應。miR-144-3p引物序列：正向引物為5′-GCAGAG TACAGTATAGATGATG-3′；反向引物為5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′。

1.7 蛋白水平檢測

提取－80 ℃凍存心肌組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，通過蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌梗死區(qū)SLC7A11，用Promega GSH/GSSG-GloTM Assay試劑盒檢測谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，方差分析用于比較正態(tài)分布組之間的測量數(shù)據(jù)；如果兩組之間的方差是均勻的，LSD檢驗被用作事后檢驗，否則使用Games Howell測試。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗；當兩組之間存在差異時，使用Mann-Whitney U檢驗，均采用雙側(cè)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 梗死區(qū)心肌中miR-144-3p表達情況

RT-PCR實驗結果提示，與control組比較，I/R組梗死區(qū)心肌miR-144-3p表達明顯升高，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預處理后miR-144-3p表達較I/R組下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 心肌組織SLC7A11蛋白表達情況

Western Blot實驗顯示，與control組比較，I/R組SLC7A11蛋白表達下降，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預處理后SLC7A11蛋白表達較I/R組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 心肌GSH、GSSG表達情況

與control組比較，I/R組GSH、GSSG表達明顯下降，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預處理后GSH、GSSG表達水平較I/R組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖3。

2.4 外周血CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T濃度比較

與control組比較，I/R組CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.5 心功能指標比較

與control組比較，I/R組大鼠LVEF、FS明顯降低，LVEDD明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組LVEF、FS明顯升高，LVEDD明顯縮小，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.6 HE染色

control組大鼠梗死區(qū)HE染色未見明顯損傷，心肌細胞排列整齊，I/R組大鼠細胞排列混亂并可見組織間隙變大，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組大鼠心臟組織病理學改變均有不同程度的改善。詳見圖4。

3 討 論

I/R是急性心肌梗死治療過程中無法避免的問題，有研究顯示，由于再灌注損傷導致的心肌損傷面積可達心肌梗死的最終心肌損傷面積的50%^[9]。I/R機制目前尚未明確，但普遍認為與再灌注過程中Ca^2＋積聚、脂質(zhì)氧化及心肌中增加的活性氧（ROS）密切相關^[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用^[12-13]，鐵螯合劑的運用可以明顯減少心肌I/R損傷^[4]。Fer-1是一種芳烷基胺類化合物，可以通過與Fe^2＋結合形成鐵素-鐵絡合物降低細胞內(nèi)Fe^2＋，減少脂質(zhì)被Fe^2＋氧化，抑制鐵死亡^[14]。在本研究中，I/R組大鼠心功能較control組明顯降低，外周血心肌損傷指標明顯升高，F(xiàn)er-1及麝香保心丸預處理后I/R大鼠心功能得到恢復，外周血心肌損傷指標明顯下降，心肌病理損傷減輕，說明鐵死亡存在于心肌缺血再灌注過程中，且可以通過藥物干預，前期研究也得到了類似的結果^[13]，同時提示麝香保心丸可以減輕心肌I/R，改善心功能。

miR-144-3p是一種與細胞凋亡密切相關的非編碼RNA，可以抑制多種細胞的增殖、遷移能力，且與氧化應激密切相關^[15-18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可以調(diào)控心肌細胞鐵死亡，且機制與降低miR-144-3p表達水平、上調(diào)SLC7A11蛋白相關^[8]。SLC7A11編碼胱氨酸/谷氨酸交換轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)XC-（xCT），抑制SLC7A11（xCT）能減少細胞外胱氨酸進入細胞質(zhì)，并減少GSH的合成，增加氧化應激。已有研究證實，SLC7A11是鐵死亡的關鍵信號分子^[19-20]。在本研究中，麝香保心丸可降低I/R心肌中miR-144-3p表達水平，并上調(diào)SLC7A11及GSH、GSSG表達量，與課題組前期細胞實驗結果相類似；GSH、GSSG能夠減輕I/R損傷中的氧化應激^[21]，提示麝香保心丸可能是通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號通路減輕心肌I/R損傷中的氧化應激。

綜上所述，麝香保心丸能改善心肌I/R，其機制可能與調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號通路，上調(diào)GSH、GSSG表達水平，抑制心肌細胞鐵死亡，減輕氧化應激相關。

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（收稿日期：2022-12-02）

（本文編輯郭懷印）