基于Nox4/NLRP3通路探討桃葉珊瑚苷干預動脈粥樣硬化的作用機制

摘要 目的：探究桃葉珊瑚苷干預動脈粥樣硬化大鼠的作用機制。方法：將SD雄性大鼠采用高脂飼料聯合維生素D₃腹腔注射的方法建立動脈粥樣硬化模型。頸動脈超聲和蘇木精-伊紅（HE）染色評估大鼠建模；建模后分為模型組、辛伐他汀組（20 mg/kg）及桃葉珊瑚苷高劑量（40 mg/kg）組、中劑量（20 mg/kg）組、低劑量（10 mg/kg）組，每組8只；另設正常組，8只大鼠給予普通飼料喂養并腹腔注射生理鹽水。分組完成后開始給藥，辛伐他汀組給予辛伐他汀溶液灌胃，桃葉珊瑚苷各劑量組腹腔注射相應劑量的桃葉珊瑚苷，正常組和模型組灌胃和注射等量的生理鹽水，每日1次，連續給藥4周。給藥結束后，檢測大鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-18、IL-1β水平；HE染色觀察頸動脈組織病理學變化；熒光探針測定頸動脈中活性氧（ROS）的生成；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測頸動脈組織還原型輔酶Ⅱ氧化酶4（Nox4）/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）通路相關蛋白的表達。結果：造模大鼠管腔內出現大量動脈粥樣硬化病變，頸動脈出現狹窄，局部血管壁上明顯有斑塊形成，頸動脈內膜中層厚度（IMT）增加，大量炎性因子浸潤。與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平和頸動脈ROS熒光強度、Nox4、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、Cleaved Caspase-1的表達明顯升高（P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05），頸動脈組織內膜層增厚，局部有斑塊形成，內皮受損，大量炎性因子浸潤；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平和頸動脈ROS熒光強度、Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1的表達明顯下降（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05），大鼠頸動脈內膜增厚、炎性因子浸潤程度減少；且桃葉珊瑚苷高劑量組對Nox4/NLRP3通路的抑制作用以及對頸動脈組織的改善作用與辛伐他汀組接近。結論：桃葉珊瑚苷可調節血脂異常、抑制氧化應激和炎癥反應，減輕動脈粥樣硬化病變，其作用機制可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關。

關鍵詞 動脈粥樣硬化；桃葉珊瑚苷；內皮功能障礙；還原型輔酶Ⅱ氧化酶4/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.012

作者單位 襄陽市中心醫院/湖北文理學院附屬醫院（湖北襄陽 441021）

通訊作者 劉娟，E-mail：47892327@qq.com

引用信息 鐘子安，劉娟，楊柳，等.基于Nox4/NLRP3通路探討桃葉珊瑚苷干預動脈粥樣硬化的作用機制[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2405-2411.

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，是心腦血管疾病的常見病因，具有多年的進行性病程，但可引起急性臨床事件，包括急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風^[1]。有研究顯示，80%的缺血性中風是由動脈粥樣硬化造成的動脈閉塞或狹窄引起的^[2]，并且通過降脂治療、適當的抗凝或抗血小板治療、適當的血壓控制以及對頸動脈狹窄的干預可以在很大程度上預防中風^[3]。因此，改善動脈粥樣硬化對于預防心腦血管疾病具有重要意義。

氧化應激被證明是動脈粥樣硬化發展的起始因素之一，與炎癥反應和脂蛋白的致動脈粥樣硬化修飾有關。氧化應激的標志是活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高。還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶4（NADPH oxidase 4，Nox4）是動脈粥樣硬化形成過程中ROS的主要來源^[4]，在血管平滑肌細胞和內皮細胞中大量表達，ROS產生增多可激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路，刺激內皮細胞炎癥并最終導致動脈粥樣硬化^[5-6]。說明Nox4/NLRP3通路在動脈粥樣硬化的形成和發展中具有重要作用。桃葉珊瑚苷（aucubin）是一種環烯醚萜苷，是杜仲、地黃、車前草等防治動脈粥樣硬化傳統中藥中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂、神經保護等多種藥理作用^[7-8]。桃葉珊瑚苷可明顯抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導的致動脈粥樣硬化脂肪因子[包括纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、白介素（interleukin，IL）-6]的分泌和mRNA合成^[9]；可促進氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）處理的人內皮細胞中一氧化氮（NO）的產生，對血管內皮功能障礙發揮預防/調節作用^[10]；還可通過抑制ROS的產生來下調Nox4 mRNA表達，抑制轉化生長因子β₁（TGF-β₁）激活的人肝星形細胞（LX-2）的活化和細胞外基質（ECM）沉積^[11]。然而，迄今為止，桃葉珊瑚苷是否對動脈粥樣硬化具有保護作用仍然未知。因此，本研究通過構建實驗性大鼠動脈粥樣硬化模型，探究桃葉珊瑚苷對動脈粥樣硬化的影響，并試圖探索其潛在的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠70只，6～8周齡，體質量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證為SCXK（京）2019-0009。將大鼠飼養在溫度（20±2）℃、濕度45%～55%環境，12 h光照/12 h黑暗周期，自由進食和飲水。適應性飼養1周后開始實驗。本研究已由機構動物護理和使用委員會批準，按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑及儀器

桃葉珊瑚苷（高效液相色譜≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司生產，貨號：T-016）；維生素D₃注射液[上海通用藥業股份有限公司生產，批號：H31021259，規格：1 mL（7.5 mg）]；辛伐他汀片（山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產，批號：H20083840）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑、RIPA裂解液和二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）-ROS活性氧檢測試劑盒（超氧化物陰離子熒光探針）購自碧云天生物科技公司；三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠ox-LDL、TNF-α、IL-18、IL-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；兔源一抗Nox4（ab133303）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-related speck-like protein containing CARD，ASC）購自英國Abcam公司，兔源一抗NLRP3、Cleaved Caspase-1、β-actin及二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H＋L購自美國Cell Signaling Technology公司。

Vevo770超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統（加拿大Visualsonics）；iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）；BX61電動顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 模型制備及分組給藥

大鼠適應性飼養1周后，分為正常組（12只）和造模組（58只）。正常組大鼠給予普通飼料喂養，造模組大鼠采用高脂飼料（2%膽固醇＋0.5%膽酸鈉＋0.2%丙硫氧嘧啶＋0.012 5%維生素D₃粉劑＋3%豬油＋基礎飼料）連續喂養12周，同時每4周給予維生素D₃腹腔注射（350 000 U/kg），建立動脈粥樣硬化模型^[12-13]。正常組大鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。建模后，超聲探測發現大鼠頸動脈有狹窄，管腔內有明顯斑塊形成，且頸動脈內膜中層厚度（intima-media thickness，IMT）增加；從正常組和造模組大鼠中各隨機選取4只大鼠，處死后取主動脈組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進行HE染色觀察主動脈病理變化。造模組可觀察到主動脈內膜增厚、粥樣斑塊形成，且內含大量泡沫細胞，說明動脈粥樣硬化模型制備成功。造模成功共46只大鼠，模型成功率為79.31%。

取造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組（20 mg/kg）^[14]及桃葉珊瑚苷高劑量（40 mg/kg）組、中劑量（20 mg/kg）組、低劑量（10 mg/kg）組^[8]，每組8只。分組完成后開始給藥，辛伐他汀組給予20 mg/kg的辛伐他汀溶液灌胃，桃葉珊瑚苷各劑量組腹腔注射相應劑量的桃葉珊瑚苷，正常組和模型組灌胃和注射等量的生理鹽水，每日1次，連續給藥4周。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 頸動脈超聲檢查大鼠建模情況

在實驗開始時和造模后，大鼠通過面罩吸入異氟烷（2%）鎮靜麻醉，并置于仰臥位。脫去頸部毛發，將掃描頭移至頸部，使用40 MHz探頭掃描頸動脈，使用長短軸視圖將左頸總動脈可視化，獲得超聲圖像，并測量管腔-內膜界面和內-外膜界面之間的距離即為IMT，測量3次，取其平均值作為IMT值。

1.4.2 血清脂質水平測定

給藥結束后，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，并使用生化試劑盒定量分析TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。

1.4.3 血清ox-LDL和炎性因子指標測定

采用ELISA試劑盒測定血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平。

1.4.4 HE染色觀察頸動脈組織病理學變化

采血完成后處死大鼠，分離頸動脈組織，生理鹽水沖洗殘留血液后等分為3份，一份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋并切成4 μm切片，二甲苯脫蠟，不同濃度的乙醇水化，用蘇木精和伊紅染色10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后在顯微鏡下觀察頸動脈的病理特征并拍照。

1.4.5 熒光探針測定頸動脈中ROS的生成

取上述分離的部分頸動脈組織，包埋在OCT化合物中并冷凍在－20 ℃下。冰凍切片機上切片（厚度為10 μm），采用DHE染色液將組織切片在37 ℃避光條件下孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去多余的DHE，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光標記的ROS并拍照，并使用Image J軟件分析平均熒光強度。

1.4.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測頸動脈組織Nox4/NLRP3通路相關蛋白的表達

取上述分離的部分頸動脈組織，加入RIPA裂解液研磨后，離心取上清液；BCA法測量蛋白濃度。取等量蛋白質樣品（每孔30 μg）在10%聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上進行電泳分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，然后將膜與一抗（Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1按1∶1 000稀釋，β-actin按1∶5 000稀釋）在4 ℃下孵育過夜，第2天，洗滌膜并用二抗[辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG，1∶5 000]室溫孵育1 h，隨后，使用增強型化學發光試劑（ECL）溶液顯色觀察條帶。Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.0和Image-Pro Plus 6.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型的建立

造模前，大鼠的頸動脈內膜很光滑。造模后，造模組大鼠管腔內出現大量動脈粥樣硬化病變：頸動脈出現狹窄，在長軸水平上探測到狹窄局部血管壁上明顯有斑塊形成，短軸將縮窄處局部放大，進一步發現管腔內有斑塊形成，且與正常組大鼠比較，造模組大鼠的頸動脈IMT明顯增加[（0.15±0.02）mm與（0.27±0.03）mm，P＜0.05]。HE染色結果也顯示，頸動脈內膜增厚，且內含大量泡沫細胞，并伴有斑塊沉積，大量炎性因子浸潤；組織病理學評估結果與超聲檢查結果一致。說明動脈粥樣硬化模型制備成功。詳見圖1。

2.2 各組大鼠血清脂質水平比較

與正常組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組血清TC、TG、LDL-C水平明顯下降（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠血清脂質水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.3 各組血清ox-LDL和炎性因子水平比較

與正常組比較，模型組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.4 各組大鼠頸動脈組織病理學變化

正常組大鼠頸動脈組織內膜、中膜、外膜結構完整，層次分界清楚，內膜層薄，未見斑塊；模型組大鼠頸動脈組織內膜層增厚，局部有斑塊形成，內皮受損，大量炎性因子浸潤，可見泡沫細胞；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷各劑量組大鼠頸動脈內膜增厚、炎性因子浸潤程度依次減少，且辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組頸動脈組織病理形態接近。詳見圖2。

2.5 各組大鼠頸動脈ROS水平比較

與正常組比較，模型組大鼠頸動脈組織ROS熒光強度明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠頸動脈組織ROS熒光強度明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠頸動脈組織ROS熒光強度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表3。

2.6 各組大鼠頸動脈組織Nox4/NLRP3通路相關蛋白表達比較

與正常組比較，模型組大鼠頸動脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠頸動脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠頸動脈組織上述蛋白表達比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖4、表4。

3 討 論

高血壓、高膽固醇血癥和其他持續效應或血流剪切力可導致內皮細胞功能障礙，內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的基礎。血液中的脂質（主要是膽固醇和膽固醇酯）以脂蛋白的形式從受損的內皮細胞進入動脈壁，引起血管局部炎癥。炎性因子可刺激單核細胞向血管壁趨化并分化為巨噬細胞，并通過吞噬修飾的脂蛋白（如ox-LDL）而形成泡沫細胞。在動脈粥樣硬化晚期，炎性細胞因子和基質金屬蛋白酶（MMP）可以降解細胞外基質蛋白，使斑塊容易破裂，導致管腔血栓形成、血栓栓塞和血管閉塞，最終導致心肌梗死或中風^[15]。

氧化應激和炎癥反應是導致動脈粥樣硬化的兩個重要因素；ROS水平升高是氧化應激的標志；血脂異常（血液中TG、TC和LDL-C升高，HDL-C降低）是動脈粥樣硬化的主要危險因素^[16]。血脂水平升高會導致ROS產生增加，而血液中升高的低密度脂蛋白（LDL）則沉積在內皮下基質中，通過增加的ROS而被氧化形成ox-LDL，導致ox-LDL水平升高。ox-LDL的過表達可破壞內皮細胞，并通過過表達凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）導致內皮功能障礙，從而誘導細胞內ROS進一步升高^[17]。Shen等^[7]研究發現，桃葉珊瑚苷可通過降低TC、TG、LDL、極低密度脂蛋白（VLDL）、TNF-α、IL-1β和血液中IL-6含量來抑制脂質積累、氧化應激和炎癥，發揮降血脂作用；還可減輕ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞功能障礙^[10]。本研究結果顯示，桃葉珊瑚苷能明顯降低動脈粥樣硬化模型大鼠血清TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，說明桃葉珊瑚苷可改善血脂異常，這與以往的研究結果一致^[7，10]。此外，有研究發現在創傷性腦損傷中，桃葉珊瑚苷可激活抗氧化酶，抑制ROS的過度生成，減少細胞凋亡^[8]。本研究在經桃葉珊瑚苷干預的動脈粥樣硬化大鼠中，通過DCFH-DA熒光探針法檢測到頸動脈ROS以及血清ox-LDL水平降低，再次證實桃葉珊瑚苷的抗氧化和調血脂特性，這可能是桃葉珊瑚苷改善內皮功能障礙的機制。

動脈粥樣硬化的氧化應激和炎癥之間存在惡性循環。在動脈粥樣硬化過程中，炎癥反應是斑塊易損過程中的主要驅動力，貫穿動脈粥樣硬化始終。Nox4是一種組成型活性酶，已被確定為ROS的主要來源之一，在許多心血管疾病中表達升高，包括動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭和缺血性中風。內皮細胞中Nox4的表達積極介導內皮功能障礙和損傷，有助于動脈粥樣硬化進展^[18]。有研究發現，Nox4介導的ROS產生促進NLRP3炎癥小體激活，在動脈粥樣硬化發病機制中具有重要作用^[19]。NLRP3炎癥小體是觸發炎癥反應激活的細胞質多蛋白復合物，由NLRP3蛋白、ASC與半胱天冬酶1前體（pro-caspase-1）組成，其激活是血管損傷的主要途徑^[20]。NLRP3炎性小體活化后，pro-caspase-1會裂解為具有活性的Cleaved Caspase-1，進而將IL-1β前體（pro-IL-1β）和IL-18前體（pro-IL-18）分別裂解為成熟的IL-1β和IL-18^[21]；IL-18可以通過增加膽固醇水平來促進動脈粥樣硬化和斑塊破裂^[22]。高IL-1β通過引發巨噬細胞和內皮細胞分泌其他炎性因子，在動脈粥樣硬化的形成和進展中發揮多重作用^[23]。此外，有研究發現，NLRP3在患有高血壓、糖尿病和高膽固醇血癥的吸煙病人的主動脈中過度表達；主動脈中NLRP3表達與LDL-C、TC呈正相關，與HDL-C水平呈負相關^[24-25]。本研究結果顯示，桃葉珊瑚苷可降低動脈粥樣硬化模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平，提示桃葉珊瑚苷可能對NLRP3炎性小體的激活具有抑制作用。

Zhou等^[26]研究發現，在動脈粥樣硬化中Nox4上調，在Nox4敲除小鼠中動脈粥樣硬化進展減少；并且Nox4缺陷小鼠顯示NLRP3炎癥小體的激活減少，以及Caspase-1激活和IL-1β、IL-18產生明顯減少^[27]。桃葉珊瑚苷在TGF-β₁誘導的LX-2細胞活化中，可下調Nox4 mRNA表達，并抑制ROS的產生^[11]。由此，推測桃葉珊瑚苷對動脈粥樣硬化的改善作用可能與Nox4/NLRP3通路有關。辛伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是一種已知的保護內皮功能的藥物，可通過下調內皮細胞NADPH氧化酶（Nox4、Nox2、p22phox等）表達，以減少ROS生成從而達到抗氧化損傷作用^[28]；還可通過調節NLRP3炎癥小體激活抑制動脈粥樣硬化^[29]。本研究結果顯示，桃葉珊瑚苷可降低動脈粥樣硬化模型大鼠頸動脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1的蛋白表達，且高劑量桃葉珊瑚苷對Nox4/NLRP3通路的抑制作用以及對頸動脈組織的改善作用與辛伐他汀接近，提示桃葉珊瑚苷對動脈粥樣硬化的改善作用可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關。

綜上所述，桃葉珊瑚苷可調節血脂異常、抑制氧化應激和炎癥反應，減輕動脈粥樣硬化病變，其作用機制可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關。本研究初步探究了桃葉珊瑚苷對動脈粥樣硬化的保護作用及潛在機制，未對Nox4/NLRP3通路進行干預，后續將采用體外細胞實驗驗證桃葉珊瑚苷抗動脈粥樣硬化的保護機制；此外，桃葉珊瑚苷是否還能通過其他途徑發揮作用，有待進一步研究。

參考文獻：

[1] LI B W，XIA Y P，HU B.Infection and atherosclerosis：TLR-dependent pathways[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2020，77（14）：2751-2769.

[2] 于玲，曹麗娟，孫靜，等.蘇木乙酸乙酯提取液靶向調控miRNA-99a抑制動脈粥樣硬化的作用機制研究[J].中國中醫急癥，2019，28（4）：585-589.

[3] SPENCE J D，AZARPAZHOOH M R，LARSSON S C，et al.Stroke prevention in older adults：recent advances[J].Stroke，2020，51（12）：3770-3777.

[4] POZNYAK A V，GRECHKO A V，OREKHOVA V A，et al.NADPH oxidases and their role in atherosclerosis[J].Biomedicines，2020，8（7）：206.

[5] LOZHKIN A，VENDROV A E，PAN H，et al.NADPH oxidase 4 regulates vascular inflammation in aging and atherosclerosis[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2017，102：10-21.

[6] 李慧丹，趙文鴿，王學惠.Nox4在同型半胱氨酸介導的動脈粥樣硬化中作用的研究[J].醫學信息，2019，32（15）：45-47.

[7] SHEN B Y，ZHAO C X，WANG Y，et al.Aucubin inhibited lipid accumulation and oxidative stress via Nrf2/HO-1 and AMPK signalling pathways[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2019，23（6）：4063-4075.

[8] WANG H，ZHOU X M，WU L Y，et al.Aucubin alleviates oxidative stress and inflammation via Nrf2-mediated signaling activity in experimental traumatic brain injury[J].Journal of Neuroinflammation，2020，17（1）：1-18.

[9] PARK K S.Aucubin，a naturally occurring iridoid glycoside inhibits TNF-α-induced inflammatory responses through suppression of NF-κB activation in 3T3-L1 adipocytes[J].Cytokine，2013，62（3）：407-412.

[10] LEE G H，LEE H Y，CHOI M K，et al.Eucommia ulmoides leaf （EUL） extract enhances NO production in ox-LDL-treated human endothelial cells[J].Biomed Pharmacother，2018，97（1）：1164-1172.

[11] LV P Y，FENG H，HUANG W H，et al.Aucubin and its hydrolytic derivative attenuate activation of hepatic stellate cells via modulation of TGF-β stimulation[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2017，50：234-239.

[12] 陳昌國，李易，王建飛，等.健脾化濁方通過NOX4/ROS/NF-κB通路調節動脈粥樣硬化大鼠主動脈炎癥及氧化應激反應的研究[J].中藥藥理與臨床，2019，35（6）：134-139.

[13] ZHANG Y M，LIU Z，ZHOU M，et al.Therapeutic effects of fibroblast growth factor-21 against atherosclerosis via the NF-κB pathway[J].Mol Med Rep，2018，17（1）：1453-1460.

[14] 周麗程，劉先發，李強，等.小檗堿聯合辛伐他汀對動脈粥樣硬化模型大鼠的抗動脈粥樣硬化作用及其機制[J].吉林大學學報（醫學版），2019，45（4）：849-854.

[15] VAISAR T，HU J H，AIRHART N，et al.Parallel murine and human plaque proteomics reveals pathways of plaque rupture[J].Circulation Research，2020，127（8）：997-1022.

[16] FARKHONDEH T，AFSHARI R，MEHRPOUR O，et al.Mercury and atherosclerosis：cell biology，pathophysiology，and epidemiological studies[J].Biological Trace Element Research，2020，196（1）：27-36.

[17] YAN L，JIA Q L，CAO H，et al.Fisetin ameliorates atherosclerosis by regulating PCSK9 and LOX-1 in ApoE^-/- mice[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2021，21（1）：25.

[18] GUO S H，CHEN X P.The human Nox4：gene，structure，physiological function and pathological significance[J].Journal of Drug Targeting，2015，23（10）：888-896.

[19] SILVIS M J M，DEMKES E J，FIOLET A T L，et al.Immunomodulation of the NLRP3 inflammasome in atherosclerosis，coronary artery disease，and acute myocardial infarction[J].Journal of Cardiovascular Translational Research，2021，14（1）：23-34.

[20] WANG X，HUANG H L，SU C，et al.Cilostazol ameliorates high free fatty acid （FFA）-induced activation of NLRP3 inflammasome in human vascular endothelial cells[J].Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2019，47（1）：3704-3710.

[21] 張林玲，石偉林.基于NLRP3/caspase-1通路研究黃芩苷對大鼠動脈硬化模型的保護作用[J].熱帶醫學雜志，2020，20（11）：1405-1409.

[22] BHAT O M，KUMAR P U，GIRIDHARAN N V，et al.Interleukin-18-induced atherosclerosis involves CD36 and NF-κB crosstalk in Apo E^–/–mice[J].Journal of Cardiology，2015，66（1）：28-35.

[23] BHASKAR V，YIN J，MIRZA A M，et al.Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice[J].Atherosclerosis，2011，216（2）：313-320.

[24] BALDRIGHI M，MALLAT Z，LI X.NLRP3 inflammasome pathways in atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2017，267（1）：127-138.

[25] POZNYAK A V，MELNICHENKO A A，WETZKER R，et al.NLPR3 inflammasomes and their significance for atherosclerosis[J].Biomedicines，2020，8（7）：205.

[26] ZHOU T，LI S N，YANG L H，et al.Correction for：microRNA-363-3p reduces endothelial cell inflammatory responses in coronary heart disease via inactivation of the NOX4-dependent p38 MAPK axis[J].Aging，2022，14（3）：1589.

[27] MOON J S，NAKAHIRA K，CHUNG K P，et al.NOX4-dependent fatty acid oxidation promotes NLRP3 inflammasome activation in macrophages[J].Nature Medicine，2016，22（9）：1002-1012.

[28] 王蕾，舒旭，伍世揮，等.辛伐他汀對內皮細胞NADPH氧化酶表達和活性氧生成的影響[J].中國藥理學通報，2011，27（9）：1276-1278.

[29] ZHUANG T，LIU J，CHEN X L，et al.Endothelial Foxp1 suppresses atherosclerosis via modulation of Nlrp3 inflammasome activation[J].Circulation Research，2019，125（6）：590-605.

（收稿日期：2022-03-03）

（本文編輯郭懷印）