基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的丁香及甘草醇提取物對尖孢鐮刀菌的影響

摘要：枯萎病是多種作物的重要土傳病害之一，孢子或者病殘體可在土壤中長期存活，導(dǎo)致該病防治困難，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害。為了對丁香、甘草2 種醇提取物抑制枯萎病機制的進(jìn)一步解析提供思路以及數(shù)據(jù)支撐，試驗采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序分析研究2 種植物提取物處理后對尖孢鐮刀菌基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，測序錯誤率均小于0.025%，且樣本組內(nèi)與組間相關(guān)系數(shù)差距較大，故測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高、生物學(xué)重復(fù)性較好。

甘草提取物處理后差異基因在GO 數(shù)據(jù)庫中主要富集到膜的組成成分和膜的固有成分，其中53.27% 上調(diào)，在KEGG 通路中苯丙氨酸代謝途徑富集最為顯著；丁香提取物處理后，在GO 數(shù)據(jù)庫中顯著富集的途徑與甘草相同，有33.98% 上調(diào)，KEGG 通路中差異基因在嘌呤代謝途徑的富集最為顯著。研究結(jié)果說明，甘草提取物對尖孢鐮刀菌的主要抑菌機制可能是在翻譯水平上促進(jìn)真菌細(xì)胞膜的多種成分的生成與代謝，與此同時減弱尖孢鐮刀菌DNA 的損傷修復(fù)功能和營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸的生成與代謝水平；而丁香提取物可能使得參與菌絲細(xì)胞生長或者菌絲抵御機制的基因過表達(dá)、RNA 代謝旺盛，促進(jìn)細(xì)胞膜的生長代謝，導(dǎo)致菌絲不能正常生長。綜上，抑菌效果顯著的2 種植物提取物對同種尖孢鐮刀菌可能具有不同的抑菌機制。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌；無參轉(zhuǎn)錄組測序；丁香提取物；甘草提取物；差異基因分析

中圖分類號：S432.4＋4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0682?08

植物枯萎病廣泛分布于世界各地，該病害是植物病害中嚴(yán)重的土傳性病害，一旦發(fā)生較難防控[1]。

其可造成植物50%～80% 的減產(chǎn)[2]甚至絕收，是危害蔬果類植物最嚴(yán)重的病害之一[3]，罹病植物常出現(xiàn)多器官及組織的腐爛[4-5]。目前枯萎病的防治主要是從化學(xué)農(nóng)藥的使用、生物菌劑（如哈茨木霉）、抗病育種、農(nóng)業(yè)措施（如嫁接、輪作）等方面入手[6]。

目前，在全球倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)的形勢下，天然來源的植物源殺菌劑在實踐中發(fā)揮了重要作用[7]。植物源殺菌劑是由植物的天然化學(xué)成分或生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物加工而成，主要通過抑制呼吸代謝、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、影響核酸及蛋白合成等方面達(dá)到環(huán)保、高效[8]、低毒害、低殘留的防治效果[9]。

RONGAI 等[10]的研究表明，石榴中的抗菌活性成分石榴鞣花酸，能減少番茄體內(nèi)的枯萎病菌的數(shù)量，對番茄枯萎病具有良好的防治效果；萬壽菊根、茼蒿莖葉[11]的乙醇提取物可以增加真菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞電解質(zhì)加速外滲，抑制菌絲的生長[12]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物源農(nóng)藥團隊前期研究表明，八角[13]、瑞香狼毒、結(jié)香花等植物提取物可以破壞菌絲的正常代謝途徑，打破原有的穩(wěn)態(tài)，且對多種枯萎菌均有一定的防治效果[14]。也有研究表明，山豆根[15]、小棗、枇杷[16]、洋蔥[17]、黃連、苦參[18]等多種植物的次生代謝成分對石榴枯萎病菌具有良好的抑菌效果。綜上所述，多種植物的次生代謝產(chǎn)物能夠在一定程度上有效地防治植物病害，并減少對環(huán)境及人畜的危害程度以及化學(xué)農(nóng)藥的依賴性，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)具有發(fā)展?jié)摿Φ木G色防控措施[19-20]。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，以及生物學(xué)研究的不斷深入，在植物源農(nóng)藥的研究中不斷涌現(xiàn)出新的思路以及方法[21-22]。本試驗基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究丁香、甘草提取物對尖孢鐮刀菌的抑菌機制，可為尖孢鐮刀菌的防治以及植物源農(nóng)藥的篩選提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

尖孢鐮刀菌菌株、甘草及丁香2 種植物的乙醇提取物均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.2 儀器與試劑

電子天平（1702-MP8，上海拓衡實業(yè)有限公司，精確度至0.001 g）、單人凈化工作臺（SW-CJ-1D，蘇州普愛德凈化設(shè)備科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）、立式自動壓力蒸汽滅菌器（立德泰勀科學(xué)儀器有限公司）、核酸濃度檢測儀（Agilent 2100 RNA 6000 Nano Kit，安捷倫，美國）等。

Trizol、氯仿、異丙醇、RNase-free ddH2O、無水乙醇、β-巰基乙醇、瓊脂糖等，均購自索萊寶公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲體制備與RNA 的提取、質(zhì)檢 在75 mL的PDB 培養(yǎng)基中加入5 個直徑5 mm 的菌餅以及終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的甘草、丁香醇提物，置于搖床中25 ℃、150 r/min 培養(yǎng)5 d。取培養(yǎng)液放置于無酶離心管中，4 ℃下 11 000 r/min 10 min、7 000 r/min5 min、5 000 r/min 1 min 梯度離心并去除上清。設(shè)置2 個生物學(xué)重復(fù)，取培養(yǎng)5 d 后的菌液約800 mg置于試管中，液氮速凍1 h，-80 ℃冰箱保存。使用TRIzol（Invitrogen）法提取菌體樣品RNA 后利用Nanodrop 2000 對所提RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測，1% 瓊脂糖凝膠、電壓5 V，15 min 電泳檢測RNA 完整性，Agilent 2100 測定RIN 值。

1.3.2 cDNA 文庫的構(gòu)建及測序 cDNA 文庫的構(gòu)建及測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，樣品檢測合格后，利用帶有Oligo（dT）的磁珠與真核生物mRNA 末端的ployA 進(jìn)行A-T 堿基配對，從總RNA 中分離出mRNA。加入Fragmentationbuffer，將mRNA 隨機斷裂，通過磁珠篩選分離出300 bp 左右的小片段。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成雙鏈cDNA 后進(jìn)行文庫富集。PCR 擴增15 個循環(huán)；2%瓊脂糖膠回收目的條帶；TBS380 定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機；cBot上進(jìn)行橋式PCR 擴增，生成Clusters；Illumina 平臺測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 轉(zhuǎn)錄組優(yōu)化組裝與質(zhì)量評估 通過Illumina平臺將測序獲得的圖像信號經(jīng)過Base Calling 轉(zhuǎn)換成文字，形成Fastq 格式的原始數(shù)據(jù)。利用Fastx_toolkit 軟件對利用index 區(qū)分獲得的每一個樣本的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估和后續(xù)分析。使用軟件SeqPrep 對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，從而得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)（Clean data）。然后利用Fastx 進(jìn)行質(zhì)量評估。利用Trinity 進(jìn)行從頭組裝生成重疊群（Contig）和單一序列（Singleton），利用BUSCO進(jìn)行組裝評估和優(yōu)化。

1.4.2 表達(dá)量及差異基因分析 利用表達(dá)定量軟件RSEM 對基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。通過計算表達(dá)量指標(biāo)TPM，確定基因的表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計，獲得基因的Read counts 數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后用DESeq2 進(jìn)行統(tǒng)計分析，基于差異基因的篩選條件為Plt;0.05 且上下調(diào)差異倍數(shù)gt;2，比較組間的差異基因。使用Goatools 軟件對差異基因進(jìn)行KEGG 和GO 通路富集分析，當(dāng)矯正后的Plt;0.05 時，確認(rèn)的功能基因認(rèn)為存在顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

丁香和甘草的乙醇提取物處理的尖孢鐮刀菌作為試驗組進(jìn)行RNA 序列的組裝與測序，由表1可知，6 個樣品數(shù)據(jù)中，空白處理的Q20 的范圍在98.32%～98.73%，Q30 的最低值不低于94.89%，GC 含量穩(wěn)定在52.45%～52.51%；丁香處理組的Q20 在98.43%～98.65%，Q30 的最低值不低于95.13%，GC 含量穩(wěn)定在53.55%～53.65%；甘草處理組的Q20 在98.15%～98.75%，Q30 的最低值不低于94.40%，GC 含量穩(wěn)定在52.49%～52.69%，測序質(zhì)量較高。

2.2 樣品間相關(guān)性分析

樣本間相關(guān)性熱圖分析如圖1 所示。

在RNA 組學(xué)研究中經(jīng)常利用相關(guān)性熱圖展示樣本之間的關(guān)系，由圖1 可知，2 個空白組生物學(xué)重復(fù)之間的基因表達(dá)水平的相關(guān)性系數(shù)是0.927，丁香處理組生物學(xué)重復(fù)之間的基因表達(dá)水平的相關(guān)性系數(shù)是0.836，甘草處理組生物學(xué)重復(fù)之間的基因表達(dá)水平的相關(guān)性系數(shù)是0.904，表明生物學(xué)的重復(fù)性較好。空白對照與丁香處理組相關(guān)性系數(shù)最大為0.699，最小為0.631，空白對照與甘草處理組相關(guān)性系數(shù)最大為0.854，最小為0.831，表明空白對照與丁香處理組之間的差異較大，與甘草處理組之間差異較小，表明丁香處理對尖孢鐮刀菌具有較大的影響，在實驗室前期研究中也表明[23]，相同濃度下丁香提取物的抑菌效果優(yōu)于甘草提取物。2 種提取物均可以進(jìn)行后續(xù)分析，同時借助樣本間PCA 分析表明（圖2），處理組與對照組的RNA-Seq 數(shù)據(jù)可靠[24-25]。

2.3 表達(dá)差異及表達(dá)量分析

對植物提取物處理的及未處理的尖孢鐮刀菌測序后所得到基因進(jìn)行差異基因的篩選后，進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計及VENN 分析，由圖3 可知，丁香提取物處理后產(chǎn)生6 570 個差異基因，其中，3 552 個差異基因顯著上調(diào)，占差異表達(dá)基因總數(shù)的54.06%；3 018 個差異基因顯著下調(diào)，占差異表達(dá)基因總數(shù)的45.94%。通過差異基因的VENN 分析得到處理后共有的差異變化的基因2 236 個，與甘草提取物處理有關(guān)的差異基因有1 591 個，與丁香處理有關(guān)的差異基因有4 334 個，丁香處理的差異基因最多。

從盒形圖的結(jié)果來看（圖4），甘草處理組的整體表達(dá)水平最高，均值為0.78，其次是對照，均值為0.73，最后是丁香處理組，均值為0.63。結(jié)果表明，甘草處理后基因表達(dá)偏高，甘草會促進(jìn)尖孢鐮刀菌中基因過表達(dá)。丁香處理后的基因表達(dá)偏低，丁香會抑制尖孢鐮刀菌的基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制真菌生長的目的[26]。

2.4 GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異基因富集分析

2.4.1 甘草提取物處理后GO 與KEGG 數(shù)據(jù)庫差異基因富集分析 從圖5 可以看出，空白對照和甘草處理中的3 826 個差異基因共得到108 個GO 功能注釋，在細(xì)胞組成（CC）中主要富集在膜的組成成分、膜的固有成分、膜部分等途徑，這些基因中有448 個上調(diào)，其中膜的組成成分中上調(diào)基因有442 個。在分子功能（MP）中包括13 個term，主要為磷脂酰肌醇磷脂酶C 活性、磷脂酶C 活性、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運活性、磷脂酶、醌結(jié)合、磷酸二酯水解酶活性等途徑，且參與這些途徑的85 個基因中有33 個表達(dá)上調(diào)。在生物過程（BP）中包含2 個term，主要為DNA 連接和DNA 連接與DNA 修復(fù)，且參與這些途徑的基因一共有4 個，全部下調(diào)。

研究結(jié)果表明，甘草處理后，尖孢鐮刀菌的細(xì)胞膜生成代謝的基因轉(zhuǎn)錄水平提高，尤其是膜的組成成分含量上升。而尖孢鐮刀菌關(guān)于DNA 的連接與修復(fù)的基因出現(xiàn)下調(diào)，細(xì)胞的損傷修復(fù)減緩，不能正常的生長。結(jié)合基因的表達(dá)量分布圖，可以了解到甘草的基因表達(dá)量提高，但是表達(dá)量提高的基因主要集中在細(xì)胞膜的基因中，蛋白質(zhì)的合成不足，因此，推測甘草提取物可能會使尖孢鐮刀菌在翻譯水平上出現(xiàn)異常，從而引起菌絲的不正常生長。

KEGG 的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，共有976 個差異Unigenes 富集在113 條KEGG 代謝通路中，共有499 個差異基因。這些差異基因中170 個上調(diào)，329 個下調(diào)。由圖5 可知，在20 條富集度最高的KEGGPasyway 中一共有227 個基因，有64 個差異基因上調(diào)，163 個差異基因下調(diào)。有15 條通路的差異基因的First Category 主要集中在新陳代謝中，有50 個上調(diào)，129 個下調(diào)，且在苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝途徑中的富集最為顯著。在這些下調(diào)的差異基因中主要是一些氨基酸代謝的基因，與對照相比表達(dá)水平降低了72%，其減少意味著真菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)不能得到有效的供給，會導(dǎo)致真菌的生長受阻，與GO分析的結(jié)果一致[27]。

2.4.2 丁香提取物處理后GO 與KEGG 數(shù)據(jù)庫差異基因富集分析 丁香提取物的差異基因GO 富集分析及KEGG 富集分析如圖6 所示。

由圖6 可知，丁香提取物處理后富集在前20 條途徑中共有2 066 個差異基因，在細(xì)胞組成中的差異基因最多有1 384 個，主要集中在膜的組成成分、膜的固有成分、膜部分、前核糖體和核仁的途徑，這些基因中有702 個上調(diào)，其中膜的組成成分中占上調(diào)基因的有442 個。在分子功能中包括3 個term，包括轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移含磷基團、DNA 定向RNA 聚合酶活性、激酶活性，且參與這些途徑的基因一共有228 個，有129 個上調(diào)。在生物過程中包含12 個term，主要為ncRNA 加工、rRNA 加工、ncRNA 代謝過程、rRNA 代謝過程、磷脂代謝過程、磷脂酰肌醇代謝過程等，參與這些途徑的基因一共有238 個，161 個差異基因上調(diào)。結(jié)合基因的表達(dá)量分布圖，可以了解到丁香的基因表達(dá)量下降，因此，導(dǎo)致丁香處理的尖孢鐮刀菌在轉(zhuǎn)錄水平上引起菌絲不能正常生長。

由圖6 可知，在20 條KEGG Pathway 中一共有374 個基因，有221 個差異基因上調(diào)，153 個差異基因下調(diào)。有11 條通路的差異基因的First Category主要集中在新陳代謝中，有131 個上調(diào)，78 個下調(diào)，且在嘌呤代謝、泛醌和其他萜類醌的生物合成、嘧啶代謝、丙酸鹽代謝途徑中的富集最為顯著。有7 條通路的差異基因的First Category 主要集中在遺傳信息處理中，有91 個上調(diào)，29 個下調(diào)，且在真核生物中核糖體的生物發(fā)生、DNA 復(fù)制、聚合酶、氨酰tRNA 生物合成途徑中的富集最為顯著；在這些上調(diào)的差異基因中主要是一些氨基酸代謝的基因，表達(dá)水平相比對照升高了59.09%，其上升意味著真菌在生長過程中出現(xiàn)了急速分泌的現(xiàn)象，使得菌絲過表達(dá)，與GO 分析的結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測序來研究丁香、甘草提取物對尖孢鐮刀菌的作用機制并獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。植物在與有害生物長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了種類豐富的高活性次生代謝產(chǎn)物，因其成分復(fù)雜，病蟲對其不易產(chǎn)生抗藥性，因此，選用丁香、甘草2 種植物的乙醇提取物作為試驗材料，可為之后大田中的實際生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

甘草處理后尖孢鐮刀菌較CK 基因表達(dá)水平提高，通過TPM 方法分析C 和G 樣品，鑒定出3 827 個差異基因，在與對照組的表達(dá)差異分析中，顯著上調(diào)的主要有甲基轉(zhuǎn)移酶活性、膜的組成成分、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸和分解代謝，顯著下調(diào)的是生物合成過程、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性，作用于酯鍵、磷酸乙烯結(jié)合、葡萄孢素生物合成、跨膜運輸和RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性。其中次生代謝產(chǎn)物的增多與生物合成產(chǎn)物的減少形成鮮明的對比，通過該結(jié)果可推測，由于次生代謝產(chǎn)物的增多可能使菌絲內(nèi)部形成大量附著物，而生物合成的減少使得真菌的生長減緩。結(jié)合GO 的富集分析，參與膜的組成成分的差異基因顯著上調(diào)，可能導(dǎo)致尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜徒長、通透性增加，使得真菌的菌絲內(nèi)壁出現(xiàn)空洞，徒留細(xì)胞膜，以上結(jié)論與實驗室前期結(jié)果相一致[28]。而且有學(xué)者針對蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜的損壞機制的研究表明，蔗糖月桂酸酯會使葡糖球菌的邊緣模糊，菌體粗糙，使得菌體的細(xì)胞膜電勢增加，出現(xiàn)物質(zhì)泄漏。另外，枯茗酸也會使菌絲細(xì)胞膜通透性和甘油含量顯著增加，表明植物提取物會使得真菌的細(xì)胞膜的通透性增加，與甘草對尖孢鐮刀菌的作用機制相似[29-30]。

與未處理的尖孢鐮刀菌相比較，丁香處理的尖孢鐮刀菌的差異基因較多，鑒定出6 570 個差異基因，這些基因參與上調(diào)的主要是糖酵解/糖異生、免疫過程和溶菌酶過程，參與下調(diào)的主要是膜的成分以及氮化合物的代謝過程。在表達(dá)差異分析中，2 種數(shù)據(jù)庫均顯示藥劑會造成膜的組成成分的差異基因顯著上調(diào)，與甘草對細(xì)胞膜的作用機制相同。

同時丁香處理的尖孢鐮刀菌的RNA 的合成與代謝的差異基因顯著上調(diào)，可能由于丁香的外界干擾，使得其代謝活躍來抵抗本身產(chǎn)生的變化。丁香還會造成真菌磷代謝的差異基因顯著上調(diào)，從而使得磷代謝加快。有學(xué)者研究表明，磷的增加有助于真菌的侵染，而磷代謝的加快會抑制真菌的侵染速率，從而導(dǎo)致丁香處理的尖孢鐮刀菌在轉(zhuǎn)錄水平上引起菌絲不能正常生長[31]。糖酵解、糖異生過程在真核生物中發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，其主要是關(guān)于對葡萄糖和蛋白質(zhì)的利用能力[32]。在表達(dá)差異分析中糖酵解、糖異生的Unigenes 顯著上調(diào)，且占比較大。

結(jié)合KEGG 富集分析，丁香處理后，氨基酸代謝水平顯著提高。糖酵解、糖異生的過程中蛋白質(zhì)的含量顯著上升，因此，在初期上升時，尖孢鐮刀菌對葡萄糖的利用率可能會上升，在生物活性測定中表現(xiàn)為初期真菌菌絲的生長較密[28]，但隨之蛋白含量上升，對葡萄糖的利用率下降，從而達(dá)到抑制真菌生長的目的。

在2 種植物提取物處理后，膜的組成成分和膜的固有成分的差異基因在GO 數(shù)據(jù)庫與KEGG 數(shù)據(jù)庫中顯著富集，推測2 種植物提取物主要作用于尖孢鐮刀菌的細(xì)胞膜。在甘草處理中參與苯丙氨酸途徑的基因表達(dá)多數(shù)降低，表明甘草對尖孢鐮刀菌的作用方式可能是抑制或提高氮代謝通路以達(dá)到防治的效果。在丁香參與嘌呤代謝途徑的作用方式可能是抑制或提高磷代謝以達(dá)到防治的目的。

后續(xù)可通過熒光定量PCR，驗證相應(yīng)基因是否下降或上升，進(jìn)一步驗證、判斷2 種植物提取物的抑菌機制。