Foxj2基因對羊駝黑素細胞黑色素生成的影響

摘要：叉頭框轉錄蛋白家族成員Foxj2（Forkhead Box J2）基因在U87 細胞和U251 細胞中與上皮-鈣黏蛋白（E-cadherin，CDH1）的表達呈正相關，且CDH1 參與黑色素的生成具有介導表皮-黑色素單位完整性的作用。為了驗證Foxj2 基因參與調節羊駝黑素細胞中黑色素的生成，采用PCR 方法驗證Foxj2 基因在羊駝皮膚內的表達情況；采用生物信息學方法分析Foxj2 與黑色素生成相關基因TYR 以及Foxj2 與黑色素的生成相關蛋白的關聯性；合成Foxj2 的siRNA 和空載siRNA，構建沉默siRNA 的羊駝黑素細胞模型，觀察記錄細胞的轉染情況；使用Real-timePCR 方法檢測各組羊駝黑素細胞中Foxj2 基因和黑色素生成相關基因TYR 的mRNA 變化；通過Western blot 的方法檢測比較各組細胞中Foxj2 與TYR 的蛋白水平的變化；提純各組細胞的3 種黑色素（總黑素、真黑素、褐黑素），使用酶標儀測各組細胞中3 種黑色素的OD 值并比較變化。結果表明，羊駝黑素細胞中檢測到Foxj2 基因表達；生物信息學分析得出，Foxj2 基因在細胞內涉及運輸氨基酸調控、生長因子等一系列作用，在Foxj2 中存在的Forkhead 結構域可以與TYR 基因啟動子存在結合位點；Real-time PCR 結果顯示，和NC 組相比，沉默組中Foxj2 的mRNA 表達量極顯著降低24 990%，TYR 的表達量顯著升高35%；Western blot 結果顯示，沉默組Foxj2 的蛋白相對表達水平極顯著降低25%，TYR 的蛋白相對表達水平極顯著升高25%。酶標儀波長分析顯示，與NC 組相比，沉默組的總黑素相對表達水平極顯著升高88.0%，真黑素相對表達水平極顯著升高21.8%，褐黑素相對表達水平極顯著升高21.6%。抑制羊駝黑素細胞中Foxj2 基因的轉錄可以升高羊駝黑素細胞中黑色素的生成，并且對黑色素生成的主要調控基因TYR 起促進作用，說明Foxj2 基因可能在羊駝黑素細胞中對于黑色素的生成起著調控作用。

關鍵詞：Foxj2；siRNA；TYR；生物信息學；羊駝黑素細胞；黑色素

中圖分類號：S829.9 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0702?07

羊駝（Vicugna pacos）作為優良的引進物種在2001 年被山西農業大學董常生教授由澳大利亞首次引入中國[1]。羊駝毛纖維天然具有20 多種顏色，可以保證零化學染色的羊駝紡織品既美觀又健康，在國內外市場十分受歡迎[2-3]。前人研究發現，動物毛發顏色的形成受到多種基因的共同調控，也受到環境和營養方面因素的影響，十分復雜[4]。酪氨酸酶（TYR）在黑色素生成中起著關鍵作用，調控著黑色素在黑素細胞內的生成數量和速度[5]。黑素細胞（Melanocyte，MC）主要位于皮膚表皮基底層和毛囊，在人和動物的心臟、大腦、眼睛虹膜等部位都有分布[6]。黑素細胞起源于胚胎時期的神經嵴細胞，由成黑色素原細胞增殖、分化而成[7]，在胚胎發育過程中，成黑色素細胞以單細胞的形式由神經嵴向著胚胎腹側開始增殖和遷移，在胚胎發育完成時成熟的黑素細胞完全形成[8]。在細胞體外培養時，成熟的黑素細胞單個細胞形態通常為梭形，細胞的胞體近似為圓形，具有至少2 個長的樹突，有時會增加至5 個樹突[9-10]。

Foxj2 基因的表達機制十分復雜，并不是在所有組織中都能夠持續的穩定表達。有研究表明[11]，在大鼠的脊髓損傷模型（SCI）中，Foxj2 會在星形膠質細胞中表達并且表達水平會隨時間的推遲呈現出起伏狀態。MIAO 等[12]和MARTíN-DE-LARA等[13]研究表明，Foxj2 基因在精子成熟過程中起著重要作用，在精原細胞和成熟的精子中不表達Foxj2 基因，但在減數分裂過程中表達。前人研究發現[12]，在胚胎時期小鼠中過表達Foxj2 基因，大部分胚胎死亡，證明過表達或突變Foxj2 蛋白對于胚胎的致死性，僅僅存活的小鼠呈現出心臟肥大、肺出血和肺水腫等癥狀，說明Foxj2 基因在胚胎時期的過表達或突變，可能是導致先天性心臟肥大和肺出血疾病的原因之一。在胚胎期間，可以從滋養外胚層（TE）和內細胞團（ICM）細胞層囊胚甚至是胚胎8 細胞時就可以檢測到Foxj2 的表達，在Foxj2缺陷型精母細胞中DNA 雙鏈斷裂修復因子（DSB）和減數分裂阻滯相關蛋白（Fzr1、Hsp70-2、Spata22、Eif4g3 和Zpac）的mRNA 表達量降低[11-13]，意味著Foxj2 基因調控精子減數分裂過程，缺失后會導致不育。

有研究表明，FOX 蛋白家族中的Foxj2 蛋白和上皮-鈣黏蛋白（E-cadherin，CDH1）具有正向調控關系[14]。鈣黏蛋白在人體皮膚細胞中起著細胞黏附的作用，有報道稱CDH1 作用于黑色素的生成和轉移并維持表皮- 黑色素單位的完整性，而且Ecadherin蛋白與β-Catenin 蛋白相結合可以共同調節黑素細胞成熟過程[15-18]。以上研究說明，Foxj2 基因可能參與毛色的調控，但是從未有研究表明，Foxj2基因與TYR 基因相關，或者Foxj2 直接影響黑色素的生成。

本研究在生物信息學、細胞生物學、分子生物學的基礎上進行試驗，首先驗證Foxj2 基因是否在羊駝黑素細胞中表達，然后驗證Foxj2 基因與黑色素的主要調控基因TYR 是否存在啟動子結合位點，最后通過細胞轉染試驗分析并檢測羊駝黑素細胞內的黑色素含量、蛋白相對含量等一系列變化，旨在揭示Foxj2 基因對于黑色素生成的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為白羊駝4 代黑素細胞（山西農業大學羊駝工程實驗室保存）。

1.2 儀器與試劑

普通PCR 儀（Eppendorf）；Real-time PCR 儀（Agilent）。

瓊脂糖、溴化乙錠Ethidium bromide（索萊寶）；2×Es Taq asterMix（CWBIO）；ddH2O（Takara）；DNA Marker（Takara）；反轉錄試劑盒（Takara）；TBGreen（Takara）；Trizol（TaKaRa）；DMEM 培養基（Life）；RIRA 蛋白裂解液（碧云天）；兔抗TYR 多克隆抗體（Abcam）、鼠抗Foxj2 單克隆抗體（Santa）、設計合成siRNA（生工生物上海股份有限公司）、Lip 2000 脂質體轉染試劑（Thermo）。

1.3 試驗方法

試驗于2016 年6 月至2018 年6 月在山西農業大學羊駝工程實驗室進行。

1.3.1 生物信息學分析和預測 查詢羊駝Foxj2基因序列、氨基酸序列、結構域、氨基酸比對NCBI（https：//www.NCBI.nlm.nih.gov/orffinder/）；利用ProtParam（http：//web. expasy. org/protparam/）對羊駝蛋白質理化性質進行分析；利用PSORT ⅡPrediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）分析羊駝Foxj2 蛋白在亞細胞定位；利用ProtFun 2.2 Server（http：//www. cbs. dtu. dk/services/ProtFun/）進行羊駝Foxj2 蛋白的功能分析；利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/Pfa/iprscan/）預測羊駝Foxj2 基因結構域；利用Jaspar（http：//jaspar.genereg.net/）分析Foxj2 基因與黑色素相關基因啟動子的關系；利用STRING（https：//string-db. org/）預測Foxj2 相關蛋白質。

1.3.2 Foxj2 序列擴增 通過NCBI 查找羊駝Foxj2 基因序列：XM_015251285.1，根據所獲Foxj2基因序列使用NCBI 來設計引物，將設計好的序列送到華大（北京）公司合成。從羊駝黑素細胞中提取RNA 并且反轉錄cDNA，反轉錄條件為：65 ℃，5 min；4 ℃，10 min。PCR 儀擴增Foxj2 基因，PCR條件：預變性，94 ℃，5 min；PCR 35 個循環，94 ℃，30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃，1 min 30 s；終止72 ℃，5 min；4 ℃，5 min。1% 瓊脂糖中電泳檢測序列。Foxj2 基因擴增引物，上游引物為Primer 5'-GACCTCGGGATGACCCTGG-3'；下游引物為5'-CGCCATCCACAGGTGCTGG-3'。

1.3.3 siRNA 序列合成 Foxj2 基因的siRNA 序列：正義鏈，GCUCCAACAUCGACUCCUUTT；反義鏈，AAGGAGUCGAUGUUGGAGCTT。

1.3.4 細胞培養和轉染 將羊駝黑素細胞在6 孔板中培養，設置沉默組、內參組（NC 組）、空白組。

細胞轉染時轉染試劑的配制分別為：沉默組A 液.含5 μL Foxj2 siRNA 溶液的 250 μL 無血清無抗生素培養基；NC 組A 液. 含5 μL NC siRNA 溶液的250 μL 無血清無抗生素培養基；B 液. 含5 μLLip 2000 脂質體轉染試劑與250 μL 無血清無抗生素培養基。

靜置3 min 后分別將2 組的A、B 液混合并靜置20 min，加入羊駝黑素細胞鋪板率80% 的6 孔板中，每孔中有無血清無抗生素培養基1 mL，37 ℃恒溫培養箱培養6 h 后更換為2 mL 正常培養基繼續培養48 h，進行顯微鏡觀測轉染效果，觀測完畢后使用胰酶消化細胞并收集細胞。

1.3.5 Real-time PCR 檢測 使用β -acting 作為Real-time PCR 的內參基因，通過Primer 5.0 軟件設計Foxj2、TYR 和β-acting 的引物（表1）。

反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，1 個循環；95 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s（熒光），40 個循環。

Trizol 法提取2 組細胞的RNA，Takara 兩步法反轉錄獲得cDNA 模板。β-acting 作為內參基因，根據熒光定量PCR 結果的CT 值計算試驗結果，基因表達水平=2-ΔΔCt，所得數據用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行t 值檢驗，3 組之間的比較全部采用方差分析。

1.3.6 蛋白免疫印記試驗 用RIPA 裂解液提取沉默組和NC 組細胞蛋白，水浴10 min 蛋白變性，取200 μg 變性蛋白進行SDS-PAGE 電泳，后進行轉膜并孵育抗體，一抗體濃度1 000 倍用TBST 稀釋，二抗濃度2 500 倍稀釋。孵育二抗后用ECL 顯色后暗室曝光，獲得長久保存的膠片條帶。用Image-ProPlus 6.0 軟件對條帶的灰度值和面積進行半定量分析，數據均通過了平均數抽樣誤差（Means±SEM≤20%），二者之間的數值比較全部采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行t 檢驗，3 組之間的比較全部采用單因素方差分析。

1.3.7 黑色素相對表達水平測定 消化下來的細胞，用2 mL PBS 吹洗后細胞計數，然后離心收集細胞。

1.3.7.1 總黑素（ASM）相對表達水平測定 加1 mL0.2 mol/L 的NaOH 溶液，85 ℃ 水浴鍋孵育5 min溶解細胞，10 700 g 離心10 min 取100 μL 上清到96 孔板，使用酶標儀在475 nm 波長進行測定。

1.3.7.2 真黑素（EM）相對表達水平測定 加750 μL 30% 氫碘酸，85 ℃ 孵育2 h，加同體積的

50% 乙醇混勻，2 230 g 離心10 min 棄上層液體取沉淀，加1 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液，85 ℃水浴鍋孵育4 h，10 700 g離心10 min 后取上清100 μL 到96 孔板，使用酶標儀在350 nm 波長進行測定。

1.3.7.3 褐黑素（PM）相對表達水平測定 加入500 μL PBS（pH 值10.5） 劇烈混勻，10 000 r/min 離心10 min，取上清加350 μL 氯仿混勻，4 000 r/min離心10 min 后取上清100 μL 到96 孔板，使用酶標儀在400 nm 波長進行測定。

1.4 數據分析

試驗采用Image-ProPlus 6.0 軟件對總黑素、真黑素和褐黑素的OD 值進行分析，采用GraphPadPrism 5.0 統計軟件進行t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 PCR 結果與分析

Foxj2 基因克隆用羊駝黑素細胞的cDNA 作為模板，在PCR 儀上擴增Foxj2 基因，獲得長1 692 bp條帶（圖1），將回收膠條送到華大公司測序確認。

2.2 Foxj2 蛋白預測

2.2.1 羊駝與小鼠的Foxj2 氨基酸比對 由于羊駝生物蛋白功能還未完全破譯，羊駝蛋白質的結構域、結合位點、相關調控蛋白通過小鼠Foxj2 蛋白比對進行分析。通過NCBI 中BLAST 功能將羊駝和小鼠的Foxj2 氨基酸比對，得出Foxj2 氨基酸蛋白在羊駝和小鼠中的一致性為86%；差異為11%。

說明Foxj2 基因在羊駝和小鼠中的蛋白差異不顯著，在不同物種之間高度保守。

2.2.2 Foxj2 轉錄因子在TYR 啟動子中的分析通過NCBI 查找小鼠TYR 基因中啟動子序列，使用Jaspar 預測小鼠Foxj2 基因在CDH1 和TYR 啟動子中的作用位點，選取評分最高的5 個結果表明，Foxj2 基因在酪氨酸酶（TYR）有結合位點（表2）。

2.2.3 Foxj2 相互作用關系蛋白質預測 通過SRING 預測可知，Foxj2 與Pogz、Rps6ka4、Rps6ka2、Rps6kb2、Srf、Sirt1、Sirt5、Mef2a、Akt1、Akt2 蛋白質有相互作用關系（圖2）。

Pogz 是轉座子，參與細胞有絲分裂過程[19]；Rps6ka4、Rps6ka2 和Rps6kb2 是核糖體蛋白激酶多肽，是參與致癌過程的幾個途徑，包括調節細胞生長、胰島素和炎癥[20-21]；Srf 是多功能轉錄因子，主要參與血清應答[22]；Sirt1 和Sirt5 是NAD+依賴性去乙酰化酶[23-24]；Mef2a 是介導鈣依賴性基因表達的轉錄因子[25]。而Akt1 和Akt2 都是一種蛋白激酶，一起作用于AKT 信號通路，可以上調黑色素的生成[26]。由此可預測，Foxj2 調控了細胞中黑色素的生成與運輸。

2.3 羊駝黑素細胞轉染后檢測

2.3.1 羊駝黑素細胞熒光觀察 羊駝黑素細胞密度達到80% 時進行轉染（圖3-A、D），轉染48 h 后通過熒光顯微鏡觀察沉默組（圖3-B、E）和NC 組（圖3-C、F）細胞轉染結果。

2.3.2 Real-time PCR 檢測 Real-time PCR 結果顯示，與NC 組相比，沉默組中Foxj2 的mRNA 極顯著降低24 9990%（Plt;0.001）（圖3-G）；TYR 的mRNA 顯著升高35%（Plt;0.05）（圖3-H）。

2.3.3 Western blot 檢測 提取轉染后沉默組和NC 組蛋白，使用Western blot 檢測（圖4-A）。通過Western blot 結果分析，與NC 組比，沉默組Foxj2蛋白相對表達水平極顯著降低25%（Plt;0.01）（圖4-B），沉默組TYR 蛋白相對表達水平極顯著升高25%（Plt;0.001）（圖4-C）。

2.3.4 轉染后總黑素、真黑素、褐黑素相對表達水平分析 收集NC 組和沉默組黑素細胞，通過酶標儀對黑色素表達水平進行測定。結果表明，與NC組相比，沉默組的總黑素表達水平極顯著升高88.0%（Plt;0.001）；真黑素表達水平極顯著升高21.8%（Plt;0.001）；褐黑素表達水平極顯著升高21.6%（Plt;0.001）（圖5）

3 結論與討論

在黑素細胞中黑色素的形成受到許多信號通路的影響，最主要的4 條信號通路是：（1）蛋白激酶DAG/PKC 信號通路；（2）Wnt/β -Catenin 信號通路；（3）cAMP/PKA 信號通路；（4）MAPK 信號通路[27-32]。研究表明，在膠質瘤細胞中Foxj2 蛋白和E-鈣黏蛋白具有正向調控關系[13-14]。E-鈣黏蛋白可以與β-Catenin 結合形成E-鈣黏蛋白/β-Catenin 復合體，該復合體調控著上皮組織中各個細胞之間的黏附和信號傳導以及黑素細胞的遷移成熟過程[33]。

在小鼠黑色素瘤B16 細胞中通過激活Akt/GSK-3β/β-Catenin 信號傳導路徑影響Wnt/β-Catenin 信號通路和TYR 的轉錄激活，從而影響黑色素的生成[34-37]。關于Foxj2 可以調控黑色素生成未見報道，本試驗通過蛋白質SRING 預測發現，Foxj2 蛋白同AKT1 和AKT2 蛋白存在相互作用關系，通過Jaspar 預測Foxj2 基因在CDH1 和TYR 啟動子中均存在結合位點。通過核酸擴增和凝膠電泳試驗確定羊駝黑素細胞中的Foxj2 基因存在穩定表達，利用Foxj2 的siRNA 沉默羊駝黑素細胞的Foxj2 的表達后發現，與NC 組相比，基因水平Foxj2 基因mRNA 極顯著降低24 990%，TYR 基因的mRNA表達水平顯著上升35%；Foxj2 蛋白相對表達水平極顯著降低25%，TYR 蛋白相對表達水平極顯著升高25%；總黑素相對表達水平極顯著升高88.0%；真黑素相對表達水平極顯著升高21.8%；褐黑素相對表達水平極顯著升高21.6%。綜上所述，Foxj2 對羊駝黑素細胞內TYR 表達和黑色素的生成存在抑制作用。另外，在生物信息學預測羊駝Foxj2 蛋白質作用時，該蛋白參與了物質運輸的功能，猜測到Foxj2與黑素小體的運輸有關，這還需要進一步的驗證。