鴨TRPM3基因與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)性分析

摘要：為探討鴨瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員3（TRPM3）基因與鴨產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性，采用Illumina高通量測序法對90 只金定鴨TRPM3 基因序列進行測序，分析TRPM3 中6 個SNP 位點的基因型頻率及與不同基因型鴨產(chǎn)蛋數(shù)和蛋質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性，并將各突變位點組成單倍型后與鴨產(chǎn)蛋數(shù)和蛋質(zhì)量差異進行相關(guān)性分析，采用熒光定量PCR 方法檢測TRPM3 mRNA 在產(chǎn)蛋數(shù)高和產(chǎn)蛋數(shù)低組鴨卵巢及輸卵管中的表達差異。結(jié)果表明，TRPM3 基因中Z-36500134 Tgt;C，Z-36503668 Agt;C，Z-36534782 Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928 Agt;G，Z-367324876 Ggt;A 單個核苷酸的突變均引起產(chǎn)蛋數(shù)顯著降低，蛋質(zhì)量顯著增加。鴨TRPM3 基因存在4 種單倍型，其中TAGCAG 單倍型為優(yōu)勢單倍型，該單倍型與鴨產(chǎn)蛋量呈極顯著正相關(guān)，與蛋質(zhì)量呈極顯著負相關(guān)。

鴨TRPM3 基因在產(chǎn)蛋數(shù)高和產(chǎn)蛋數(shù)低組輸卵管中的表達差異不顯著，在產(chǎn)蛋數(shù)低組卵巢中的表達量顯著低于其在高產(chǎn)蛋組卵巢中的表達量。以上結(jié)果說明，TRPM3 在鴨的產(chǎn)蛋性能中可能發(fā)揮重要作用，而且可能是通過影響卵巢的功能而影響其產(chǎn)蛋性能。

關(guān)鍵詞：鴨；TRPM3；產(chǎn)蛋數(shù)；Illumina 高通量測序法；蛋質(zhì)量；相關(guān)性

中圖分類號：S834 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0716?05

TRPM3 基因（瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員3）是瞬時受體電位家族成員，位于人9 號染色體。KUNIBA 等[1]于2009 年采用基因芯片技術(shù)在41 例歌舞伎綜合征患者的9q21.11-q21.12（約1.27 Mb）區(qū)域篩查到該區(qū)域10 個堿基替換，其中包含基因TRPM3，因此，推測TRPM3 的突變可能與歌舞伎綜合征有關(guān)。2020 年，SHIELS 等[2]研究表明，TRPM3 為一種自發(fā)性的鈣離子通道，對細胞鈣信號和穩(wěn)態(tài)很重要，可與TRPM1 形成異多聚體離子通道，對鈣離子和鋅離子是可滲透的且TRPM3 通道的激活與體感神經(jīng)元的熱感覺、胰腺β 細胞的胰島素分泌，神經(jīng)遞質(zhì)釋放、虹膜收縮和促進腫瘤發(fā)生有關(guān)[3-6]。一直以來，TRPM3 在瞬時受體電位家族中是研究較少的一員，最近由于發(fā)現(xiàn)其在大腦病理學(xué)中的重要作用而受到廣泛關(guān)注[7]。

DYMENT 等[8]2019 年報道TRPM3 的從頭錯義突變與智力障礙和癲癇有關(guān)。DE SAINTE AGATHE等[9]發(fā)現(xiàn)TRPM3 中Val837Met 的突變與眼部和關(guān)節(jié)缺陷有關(guān)，并伴有非強制性癲癇。迄今為止，TRPM3 基因在家禽中的研究報道極少。僅見CUI等[10]2020 年報道，雞萎縮性卵巢中miR-204 高表達，該miRNA 的高表達促進了卵巢顆粒細胞凋亡并抑制其自噬，且miR-204 上述作用的發(fā)揮是通過TRPM3/AMPK/ULK 通路靶向抑制TRPM3 的表達而實現(xiàn)，揭示TRPM3 在家禽卵巢顆粒細胞中發(fā)揮重要作用。通過查詢NCBI 發(fā)現(xiàn)，TRPM3 基因位于小鼠、狗和豬的1 號染色體，大鼠的19 號染色體，雞、鴨的Z 染色體。Z 染色體在家禽中為性染色體，只在母禽中存在，進一步揭示TRPM3 在母禽中可能發(fā)揮非常重要的作用。

江蘇省家禽科學(xué)研究所水禽課題組前期通過對產(chǎn)蛋量高和產(chǎn)蛋量低的2 組金定鴨全基因組混池重測序發(fā)現(xiàn)，TRPM3 基因是與鴨產(chǎn)蛋量相關(guān)的候選基因之一，進一步測序和多重比對顯示，該基因上存在多個SNP 突變位點，揭示其在鴨的產(chǎn)蛋調(diào)控中可能發(fā)揮作用。為了進一步驗證TRPM3基因在母鴨產(chǎn)蛋中的作用，本研究采用Illumina 測序平臺對TRPM3 基因上6 個SNP 位點進行測序分型，將6 個SNP 位點組成的單倍型與鴨產(chǎn)蛋性能進行相關(guān)性分析，同時檢測了TRPM3 在產(chǎn)蛋數(shù)不同鴨卵巢和輸卵管組織中的mRNA 表達水平差異，旨在探討其在產(chǎn)蛋性能中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選擇228 只產(chǎn)蛋高峰期的金定鴨，從全群鴨日產(chǎn)蛋率達50% 時每天記錄每只鴨的產(chǎn)蛋量，連續(xù)記錄150 d，統(tǒng)計每只鴨150 d 的產(chǎn)蛋數(shù)。分別于299、300、301 d 時連續(xù)稱取蛋質(zhì)量，記錄為300 d 平均蛋質(zhì)量。每只鴨翅靜脈采集抗凝血2 mL，用于DNA 提取。同時按照從高到低的順序，選擇產(chǎn)蛋量排名前30 的鴨為高產(chǎn)組鴨，排名后30 的鴨為低產(chǎn)組鴨，分別統(tǒng)計2 組鴨的產(chǎn)蛋量和蛋質(zhì)量，2 組分別隨機選擇8 只，采集輸卵管膨大部和卵巢皮質(zhì)部組織，保存于-20 ℃冰箱用于RNA 提取。

1.2 DNA 提取、PCR 擴增和文庫構(gòu)建

參考NCBI 中PekingDuck_PBH1.5 基因組信息，確定金定鴨TRPM3 基因上6 個突變位點的基因組位置。采用血液小量提取試劑盒提取各樣本DNA（TIANGEN，DP348），采用多重PCR 方法對樣本進行擴增，PCR 擴增引物序列如表1所示。其中，第1 輪PCR 反應(yīng)體系為：Primer Mix（50 nmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，10×Buffer 1.0 μL，基因組DNA（20 ng/μL）2.0 μL，Mg2+（100 mmol/L）1.0 μL，石蠟油10.0 μL，ddH2O 3.1 μL，共20.0 μL。第1 輪PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；，94 ℃ 30 s，60 ℃ 10 min，4 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)。第2 輪PCR 擴增體系為，Barcode（2.0 μmol/L）3.6 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，第1 輪擴增產(chǎn)物稀釋液10.0 μL，Mg2+（100 mmol/L）1.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，ddH2O2.5 μL，石蠟油20.0 μL，共40.0 μL。第2 輪PCR 擴增反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 4 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃30 s，10 個循環(huán)。對2 輪擴增獲得的PCR 產(chǎn)物進行混樣，混樣后對文庫進行純化并精確定量后稀釋至測序所需質(zhì)量濃度（10.0 ng/μL）。

1.3 高通量測序

基于Illumina X-10 測序平臺對TRPM3 基因中6 個SNP 位點進行測序，具體流程為：橋式PCR，采用NaOH 將雙鏈DNA 文庫變性為單鏈，將單鏈DNA雜交到Flow Cel（l 流動槽）上，以Flow Cell表面的Oligos 為引物合成第1 鏈，沖洗單鏈DNA，并以合成的第1 鏈為模板進行橋式PCR，去除與P5接頭連接的DNA 單鏈，阻斷3'-OH；測序反應(yīng)，將橋式PCR 產(chǎn)物上機測序，所用平臺為IlluminaX-10，操作流程按照標準化工作流程進行，根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計每個樣本各SNP 位點的基因型。

1.4 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄

采用TRNzol 法提取總RNA，提取流程按照TRNzol Universal 總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP424）的說明書進行，采用分光光度計檢測RNA的純度和含量，經(jīng)檢測，OD260/OD280 為1.8～2.1 定為合格，將檢測合格的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄具體操作參照FastKing 試劑盒一步法除基因組cDNA 第1 鏈合成預(yù)混試劑（TIANGEN，KR118）說明書。

1.5 熒光定量PCR

根據(jù)NCBI 上鴨TRPM3 基因的參考序列（Gene No：XM_038170831），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計TRPM3 mRNA 引物，TRPM3-F：5'-GGTGTTGCTGTGGGCGTCTAATAG-3'，TRPM3-R：5'-GCTTGCTGATGGACCACTTCTCTG-3'；以鴨持家基因ACTB（NM_001310421.1）為參考序列，引物為ACTB-F：TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'，ACTB-R：5'-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3'。采用SYBR Green 法進行熒光定量PCR，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為：cDNA 2.0 μL，2×SYBRreal-time PCR premix 10.0 μL，50×ROX ReferenceDye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，總體積20.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，20 s；60 ℃，15 s；72 ℃，15 s，共40 個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 軟件對TRPM3 基因上6 個SNP 位點的基因型及其單倍型鴨的產(chǎn)蛋數(shù)和蛋質(zhì)量進行單因素方差分析，比較不同基因型及單倍型間的產(chǎn)蛋數(shù)和蛋質(zhì)量差異。采用雙因素方差分析法分析不同單倍型與產(chǎn)蛋數(shù)和蛋質(zhì)量的相關(guān)性。

采用2-ΔΔCt 方法分析TRPM3 基因在鴨卵巢和輸卵管中的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨TRPM3 突變位點及與產(chǎn)蛋性能分析

由表2可知，Z-36500134Tgt;C，Z-36503668Agt;C，Z-36534782Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928Agt;G，Z-36732487Ggt;A 突變位點的單個核苷酸的突變均引起產(chǎn)蛋數(shù)顯著降低（Plt;0.05），300 d蛋質(zhì)量顯著增加（Plt;0.05）。

2.2 鴨TRPM3 基因單倍型與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)分析

檢測了216 只鴨TRPM3 基因的6 個SNPs，共發(fā)現(xiàn)4 種單倍型，結(jié)果如表3 所示，其中野生單倍型TAGCAG為優(yōu)勢單倍型，頻率為0.625；而CCATGA、TAGCAA 和CAGTAA 突變單倍型，占比較小，頻率分別為0.250、0.014和0.111。野生單倍型TAGCAG的鴨產(chǎn)蛋量顯著高于突變單倍型CCATGA 和TAGCAA（Plt;0.05）；而蛋質(zhì)量在野生單倍型鴨顯著低于突變單倍型CCATGA 和CAGTAA（Plt;0.05）。相關(guān)性分析表明，不同單倍型與鴨產(chǎn)蛋量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與鴨300 d 蛋質(zhì)量呈極顯著負相關(guān)（Plt;0.01）。

2.3 鴨產(chǎn)蛋量分組和TRPM3 mRNA 相對表達量分析

從圖1-A 可以看出，鴨TRPM3 基因在低產(chǎn)組的產(chǎn)蛋數(shù)顯著低于在高產(chǎn)組的產(chǎn)蛋數(shù)（Plt;0.05）。

從圖1-B 可以看出，TRPM3 基因在不同組間輸卵管中表達量高，但差異不顯著（Pgt;0.05），鴨卵巢TRPM3 mRNA 在低產(chǎn)組表達量顯著低于在高產(chǎn)組的表達量（Plt;0.05）。

3 結(jié)論與討論

鴨的產(chǎn)蛋性能是衡量蛋鴨經(jīng)濟價值的重要指標。研究表明，多個基因與鴨的產(chǎn)蛋性能相關(guān)，如NPY、VIPR、PRL 與連城白鴨的產(chǎn)蛋性能相關(guān)[11]，F(xiàn)SHR 基因與金定鴨的產(chǎn)蛋性能相關(guān)[12]。最近采用全基因組重測序的方法在紹興鴨中發(fā)現(xiàn)了MARCHF6、ATP6V0D2、GRIN3B、MARCHF6、CA2、WDR18、GRIN3B 等多個與產(chǎn)蛋量相關(guān)的候選基因[13]。江蘇省家禽科學(xué)研究所水禽育種與生產(chǎn)課題組在對金定鴨的高通量測序中首次發(fā)現(xiàn)TRPM3 基因上存在幾個堿基突變，揭示該基因可能影響了鴨的產(chǎn)蛋量。進一步檢測了金定鴨TRPM3 基因上的6 個SNP 位點，分析不同基因型鴨產(chǎn)蛋數(shù)和300 d 蛋質(zhì)量的差異，發(fā)現(xiàn)Z-36500134Tgt;C，Z-36503668Agt;C，Z-36534782Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928Agt;G，Z-36732487Ggt;A 突變位點的單個核苷酸的突變均引起產(chǎn)蛋數(shù)顯著降低，蛋質(zhì)量顯著增加。本研究在金定鴨中檢測到TRPM3 基因的4 種單倍型，其中，TAGCAG為野生單倍型，亦為優(yōu)勢單倍型，與高產(chǎn)蛋量和低蛋質(zhì)量極顯著相關(guān)，揭示該單倍型可作為鴨高產(chǎn)蛋量的分子標記用于標記輔助選擇育種。以上這些結(jié)果表明，TRPM3 基因突變顯著影響鴨的產(chǎn)蛋性能。

LEE 等[14]于2003 年研究表明，TRPM3 基因在人的大腦、脊髓和睪丸中高表達，而在其他組織中幾乎不表達。GRIMM 等[15]2003 年通過Northern Blot和RT-PCR 的方法檢測了TRPM3 在人組織中的表達情況，結(jié)果表明，TRPM3 在人腎臟、大腦、卵巢和胰腺中表達，且在腎臟中的表達高于其他組織。

FONFRIA 等[16]2006 年研究也表明，TRPM3 在腦、垂體、腎臟和脂肪組織中的表達均比較豐富，在其他組織中表達量較低或不表達。近年來的研究進一步表明，TRPM3 在多種組織中廣泛表達，包括腎、腦、脂肪和胰腺等，并在維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、胰島素分泌和體感神經(jīng)元的熱感中發(fā)揮重要的生理功能[3，17-18]，并能夠在血管平滑肌的細胞收縮和細胞因子分泌中發(fā)揮作用[19]。在卵巢癌上皮細胞中的研究表明，TRPM3 基因在卵巢癌細胞中表達量顯著增加，而且可能通過調(diào)控Beclin1 促進卵巢癌細胞的自噬[20]。TRPM3 還可能通過激活Wnt/β-catenin 通路促進卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進而增強卵巢癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[21]。TRPM3 基因在雞卵巢顆粒細胞中表達，作為miR-204 的靶基因，在調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的自噬中發(fā)揮重要作用[10]。

本試驗通過對鴨TRPM3 基因的SNP 位點檢測、SNP 位點與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析，以及TRPM3 在產(chǎn)蛋數(shù)不同鴨卵巢和輸卵管組織中的mRNA 表達水平差異的研究，結(jié)果表明，TRPM3在鴨產(chǎn)蛋性能中發(fā)揮作用，但具體的調(diào)節(jié)作用機制尚不清楚，后續(xù)研究中，將會更深入研究TRPM3在鴨卵巢及卵巢細胞中的作用及信號調(diào)控機制，以進一步明確TRPM3 在家禽中的作用。